用多克隆抗体包被磁性微球以制备捕获探针。表面上装有大量三联吡啶钌标记的抗噬菌体抗体已被用作发光探针，以有效地放大信号。该方法检测相思毒素，其浓度在0.005〜100μg/ L范围内与电化学发光强度具有良好的线性对数关系，调整方程为lgY = 0.701lgX 1.767（R = 0.9964，N = 7，p <0.0001），检出限达到0.005μg/ L（S / N = 3）。使用单克隆抗体制备标记探针相比，检测灵敏度提高了20倍，可用于检测微量的阿拉伯胶毒素。化学发光免疫传感器（ECL）检测蛋白质生物大分子。大多数情况下，固定在传感器表面的抗体用作捕获探针，而发光标记（如联吡啶钌[Ru（bpy）2 3]）用作发光探针。标形成“捕获靶标-发光探针”复合物，电极表面发生ECL反应，确定靶标浓度[1〜5]。体活性和标记量将直接影响检测灵敏度。于传统抗体，可用于分子表面标记的基团是有限的，多位标记也可能影响其结合活性，这限制了灵敏度的进一步提高。
菌体抗体是一种通过噬菌体技术获得的可溶性抗体片段，或者是在表面展示抗体片段的噬菌体[6]。于后者，除了展示的抗体片段外，表面是大量的衣壳蛋白。显示可变的单链片段（scFv）的噬菌体M13为例，M13是丝状的，长约900 nm，宽约8 nm，衣壳约2800个在5kDa组成的主要衣壳蛋白p 1中[7]，scFv融合蛋白在次要衣壳蛋白pIII的一个拷贝上以大约5个拷贝的一端表达。果进行了标记，那么将有更多的标记物附着在大量的衣壳蛋白上[8]，表明该抗体只是“隐藏”在尖端的一个小角上，因此标记物更少。标记。量减少因多站点标记而导致的活动减少或消失。此，作为标记探针的噬菌体呈递抗体可显着增加标志物的数量并至少影响结合活性，从而在信号放大中起作用。这项研究中，高毒性生物毒素相思毒素（Abrin）被用作检测目标，涂有Abrin多克隆抗体（多克隆抗体）的磁性微球被用作捕获探针，Abrin噬菌体标记为Ru （ bpy）2 3被显示。抗体是一种发光探针，结合了磁性微球的分离和富集与载有大量发光标记的噬菌体展示抗体，可放大ECL信号。立了一种新的阿布林检测方法，该方法可以有效地放大检测信号并提高检测灵敏度。性免疫电化学发光检测平台（由本实验室与西安瑞迈分析仪器有限公司共同开发），MPI-E电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限公司） ）; BIOMATE 3S紫外可见分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）； HS-3立式搅拌机（宁波鑫之生物科技有限公司）；磁分离框架（美国Promega）。吡啶吡啶N-羟基琥珀酰亚胺钌酯（Ru（bpy）2 3-NHS酯，美国西格玛），活化生物素（Biotin-NHS酯，美国西格玛）;磁性微磁涂层有链霉亲和素Balle（New England BioLabs，直径2.0μm），Abrin，Abrin多克隆抗体，Abrin单克隆抗体，Abrin抗噬菌体抗体，蓖麻毒蛋白（Ricin），葡萄球菌肠毒素B（SEB，我们的实验室）;带有CleanCell清洗液的荧光检测溶液（北京百隆腾技术开发有限公司）；牛血清白蛋白（上海国药集团有限公司，BSA）；用0.1mol / L的Na 2 HPO 4，0.1mol / L的KH 2 PO 4和0.1的磷酸盐缓冲溶液（PBS）用mol / L的KCl制备。
验用水是去离子水，使用的其他化学药品和试剂均为分析纯。获探针的制备（1）聚鸟氨酸Abrin用1 mg DMSO溶解1 mg活化的生物素并加入120μL活化的生物素溶液（即含有活化的生物素）加入1 ml Abrin多克隆抗体溶液（1 mg / ml）。120微克）;在室温下连续搅拌，保持2-4小时；加入9.6μL1 mol / L NH4Cl（25μg活化生物素为1μL），在室温下搅拌10分钟;通过超滤消除结合激活生物素并重悬于1 ml PBS中。（2）磁性微球捕获探针的构建向1 ml（1 g / L）涂有抗生物素蛋白的磁性微球中添加20μL生物素化的abrin多克隆抗体，在室温下摇动孵育1 h，然后置于磁分离样品架用PBST（含0.15％Tween-20的PBS）洗涤两次，并用PBS洗涤两次以除去未结合的多克隆抗体Abrin，剩余的磁性微球与加入Abrin多克隆抗体，并用PBS重悬于1 ml，4。持在℃下以备将来使用。了进行ECL检测，将50μL涂有Abrin抗体的磁性微球与50μL样品混合，在室温下摇动孵育15分钟，放在磁性分离载体上并用PBS洗涤两次，然后添加标记50μL探针，用于在室温下摇动混合并孵育1小时，结合磁分离，用PBS洗涤两次，重悬发光检测溶液，并添加到检测池中，即复合磁体在磁铁的作用下，带有磁性微球的金属沉积在工作电极的表面上，并且在给定的工作电极和参考电极之间的恒定电压为1.4，在V，Ru（bpy ）噬菌体上标记的2 3与发光检测溶液中的三丙胺（TPA）反应，并且光信号由光电倍增管（PMT）检测。个检测过程如图1所示。ECL反应完成后，将磁体移至距离电极最远的位置，首先用离子束清洁检测池和电极。离子水，CleanCell清洁溶液和电化学脉冲相结合，然后用去离子水和ProCell发光检测溶液冲洗，直到ECL值恢复到参考水平（空白信号），则执行下一个系列的测试。光探针的UV-Vis光谱如图2所示。噬菌体Abrin展示抗体被标记后，UV-Vis光谱发生变化。是abrin噬菌体展示抗体的光谱，由于噬菌体颗粒，在269nm处有一个特征吸收峰。
酸被包裹在衣壳蛋白中，DNA吸收峰在269 nm处反射； b是Ru（bpy）2 3-NHS酯标记图，在220至600 nm之间有3个钌联吡啶特征吸收峰，其中在457 nm可见光处的吸收对应于金属Ru到配体bpydπ，电荷π*，在紫外区域的287 nm处的吸收是一个过渡π，π*以配体为中心，另一个在紫外区域的吸收，在245 nm处的吸收峰也为从金属Ru到配体bpy的电荷跃迁dπ，π* [11]； c是Ru（bpy）2 3噬菌体呈递抗体Abrin的声谱图，位于285 nm的吸收峰处。应该位于吡啶联吡啶在287 nm的吸收峰处。254 nm处的吸收应与联吡啶钌在245 nm处的吸收相对应，向红色略有偏移。
457 nm处，恒温阀芯是钌联吡啶的特征吸收，表明Ru（bpy）2 3-NHS酯已在抗噬菌体抗体上标记。为单链抗体Abrin显示在噬菌体M13的表面上，并且由于M13大且呈丝状，所以与抗体相比，其运动非常缓慢，并且由于scFv位于一端，因此减少了M13与Abrin接触的风险。究潜伏时间。Abrin浓度为50μg/ L时，在向Abrin噬菌体呈递加入Ru（bpy）2 3抗体后，分别孵育10、20、30、40、50、60、70和80分钟。学发光强度的变化如图4所示。孵育时间少于60分钟时，光照强度随孵育时间的增加而逐渐增加；当孵育时间少于60分钟时，光照强度逐渐增加。孵育时间超过60分钟时，光强度趋于稳定。表明60分钟后，室温下的M13结合反应基本饱和。此，孵育时间为添加标记探针后的60分钟。
展示单链抗体Abrin的噬菌体M13为载体构建发光标记探针，将大量的吡啶吡啶钌信号分子固定在噬菌体M13的表面上，有效地放大了发光信号并成功建立高度灵敏，特异的三明治通过电化学发光免疫敏化的新检测方法。种方法比使用单克隆抗体作为标记探针的灵敏度高20倍。以基于该方法开发性能稳定的试剂。
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