用于三磷酸腺苷（ATP）适体的电化学时间库仑传感器是可重现的。链DNA是自组装的，并通过AuS键连接到电极表面，而ATP适体与短链DNA杂交以结合到电极表面。负电荷的DNA通过静电吸引与电解质中的六氨合钌（RuHex）阳离子结合。育ATP传感器和目标分子后，ATP结合到核酸适体上，使适体链从电极表面解离，吸附在表面上的DNA量增加。极已减少，RuHex键的数量也相应减少。ATP的定量测定可以通过定时库仑技术检测RuHex响应信号的降低来进行。自该传感器的电化学响应信号与ATP浓度的对数呈线性关系。性检测范围为0.001〜100μmol/ L，检测极限（S / N = 3）为0.5 nmol /L。旦该传感器检测到目标ATP分子，即可对其进行再生通过简单的操作步骤，再生5次后的响应信号大于初始信号的90％。鼠脑透析液中的ATP含量为（19.2±3.7）nmol / L（n = 3）。物检测技术在疾病的预警和诊断，临床治疗等方面具有良好的应用价值。[1至3]。生理和病理过程相关的许多生物活性分子在人体中很弱，易于降解且难以检测。此，具有良好选择性和高灵敏度的鉴定元素的开发和筛选一直是有关研究人员关注的重点[4-6]。酸适体，作为一种新型的生物传感器识别元件，越来越多地用于基础和应用研究[7-10]。酸适体是通过配体的系统进化技术筛选的特定序列的DNA或RNA的寡核苷酸链，具有高选择性和与靶标的强亲和力。择性和亲和力甚至强于其天然配体[11-13]。天然配体相比，核酸适体具有制备成本低，恒温阀芯稳定性好的优点。磷酸腺苷（ATP）在诸如能量代谢，信号传导和神经元发育等生物过程中起着关键作用[14，15]。献中描述的用于检测ATP的方法包括荧光方法[16]，化学发光方法[17]，生物发光方法[18]和电化学方法[19]。物流体中ATP的浓度为109-108 mol / L。
立高度选择性和灵敏的ATP检测方法是科学研究人员的难题[20，21]。化学方法具有灵敏度高和检测限低的优点。酸适体具有良好的选择性作为识别元素，使用电化学核酸适体传感器检测ATP已成为最热门的研究主题之一[ 22〜25]。]。用核酸适体作为识别元件的电化学传感器通常使用标记有电化学活性基团的DNA链作为标记探针，以将核酸适体的识别过程转化为靶标并转化为电化学响应信号[ 26-30]。未标记的电化学传感器相比，标记探针型适体电化学传感器的构建过程更加复杂，制备成本较高。氨合钌（RuHex）作为一种电活性分子，具有正电荷。果DNA链连接到电极表面，RuHex将与带负电荷的DNA主链静电连接[31]。过检测吸附在电极表面上的RuHex的响应信号，可以定量测定固定在电极表面上的DNA链。于上述原理，Shen等。[32]通过将腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）的适体与其互补链杂交形成的双链DNA固定在电极表面作为识别元件，并构建了未标记的核酸衔接子。体电化学传感器。AMP与电极表面的适体结合，从而与其互补链解离，并且附着在电极表面的DNA总量减少，从而导致AMP量减少。RuHex吸附在电极表面，因此可以定量测定MPA和检测范围它为1.0×107×1.0×103 mmol / L，检测极限低于0.1μmol/ L.焦等。[33]报道了一种库仑电化学适体核酸传感器来检测凝血酶，该传感器使用纳米金作为信号增强剂。测凝血酶的线性范围为0.1至18.5 nmol / L，检测极限为30. pmol / L。[34]建立了一个库仑型定时传感器，使用纳米金扩增来检测ATP。性检测范围为1.0×109×1.0×105 mmol / L，检测限为0.2nmol / L。造了时间库仑型核酸适体传感器。Qiu [35]和Du [36]提出的方法可以再生，并且传感器在再生处理后至少可以重复使用3次。这项研究中，与ATP适配子序列之一互补的短链DNA连接到电极表面，并将适配子与短链DNA杂交以构建库仑型timomb ATP电化学传感器。RuHex是一种电化学活性分子，被添加到电解质中，带负电荷的DNA通过静电作用吸附RuHex。将ATP添加到系统中时，ATP与核酸适体结合形成特定的二级结构，从而从电极表面掉落的互补链中解离出来，电极表面上的DNA减少，RuHex吸附在电极表面上。
量也相应减少，并且库仑响应信号的时间减少。ATP靶分子的检测是根据来自传感器的响应信号的减少进行的。测后，将电极表面与未标记的核酸适体一起孵育并重新杂交，以再生传感器的表面。这项研究中构造的传感器是通用的，其制备和再生方法很简单。传感器用于检测大鼠脑透析液中ATP的浓度，与文献报道的结果一致，表明该传感器可用于实际生物样品中的检测。CHI660B电化学工作站（上海晨华仪器有限公司）。化学测量使用三电极系统：经DNA修饰的金电极（Φ= 2 mm，是工作电极），Ag / AgCl电极是参比电极，Pt线是对电极。DNA序列（见表1）由Biotech Bioengineering（Shanghai）Co.，Ltd.合成。磷酸腺苷（ATP），三磷酸胞嘧啶（CTP），三磷酸鸟苷（GTP）和三磷酸尿苷（UTP）购自上海元野生物科技有限公司。Trismethylaminomethane（Tris，Amresco，USA）公司）；六胺合钌（RuHex，Sigma，美国）; 3巯基丙酸（MPA，阿克罗斯（Geros，比利时））；大鼠脑透析液（北京梦和重生科技有限公司），脑透析该液体取自大鼠右腹侧海马脑区，透析探针的膜长度为4 mm，流速为人工脑脊液的输注速度为3μL/ min，在平衡输注90分钟后，在低温环境下开始收集透析液。透析液未进一步处理。研究中使用的试剂具有分析质量。验用水是超纯水（法国Millipore公司的MilliporeD 24UV水表）。
电极依次用粒径为0.30和0.05μm的Al2O3粉末悬浮液抛光，然后用丙酮和超水超声清洗每次纯净5分钟。洁过的电极在0.5 mol / L的H2SO4溶液中以0.5 V / s的扫描速度在0.2至1.6 V的电势范围内扫除，直至获得清洁金电极特性的典型循环伏安图。50μLCDNA溶液施加到电极表面，并通过自组装将巯基标记的CDNA固定在金电极的表面上。后，将50μL10μmol/ L的DNA排到该电极的表面，并孵育2小时，以使DNA和cDNA杂交形成双链结构。电极浸入0.1 mmol / L的MPA溶液中10分钟，然后用乙醇和超纯水彻底清洗电极，以去除残留在电极上的MPA。极表面和弱吸附分子。化学检测是在含20μmol/ L RuHex和20 mmol / L TrisHCl的缓冲液中进行的。仑电化学检测的脉冲宽度为600 mV，脉冲周期为250 ms。冲微分伏安法的电位范围为0.5〜0 V，脉冲宽度为0.05 s。研究中构建的时间库仑ATP适体电化学传感器的检测机理如图1所示。先，通过5’硫醇标记的CDNA通过自组装的方式固定在电极表面AuS结合，并且ATP适体通过杂交连接到CDNA，将其固定在电极表面。于磷酸盐DNA主链带负电，因此添加RuHex时，固定在电极表面的DNA通过静电吸引与RuHex结合。时，可以检测到RuHex电化学响应信号。检测到ATP时，ATP和适体结合形成特定的二级结构，从而导致CDNA适体的DNA链解离，电极表面掉落。着附着在电极表面的DNA量的减少，通过静电吸引而吸附在电极表面的RuHex的量也减少，RuHex的响应信号也减少。ATP分子的定量测定可以通过检测RuHex信号的减少来进行。检测之后，再次进行ATP适体和固定在电极表面上的CDNA的杂交以再生传感器。RuHex和DNA寡核苷酸链可以在静电吸引的作用下形成复杂的RuHexDNA结构。含有RuHex的电解质中，通过具有固定DNA的金电极的差分脉冲伏安法（DPV）扫描具有两个氧化峰。[32]，在0.15 V的氧化峰属于RuHex扩散控制峰，而在0.32 V的氧化峰是RuHex吸附在电极表面的特征峰。DPV曲线如图2所示。通过扫描固定在金电极上的CDNA所获得的DPV曲线相比，CDNA和ADNA杂交后在0.32 V处的氧化峰电流增加了显着。电极用于检测100μmol/ L的ATP，并通过扫描获得DPV曲线。0.32 V处的氧化峰电流显着降低，表明附着在电极表面的DNA数量减少，并且吸附在电极表面上的RuHex数量减少了。应地减少了。究了CDNA浓度对固定在电极表面的CDNA数量以及DNA杂交后1 mmol / L ATP的DPV响应信号的影响。定在电极表面的DNA密度可以通过定时库仑技术确定[29]。饰电极中使用的CDNA浓度分别为0.5、1、5、10和50μmol/ L。定在电极表面的CDNA密度随CDNA浓度的增加而增加用于修饰电极。电极与适体结合时，通过检测1 mmol / L ATP获得的响应信号ΔQ也增加。ΔQ的计算方法请参照3.4节。用于修饰电极的CDNA浓度大于10μmol/ L时，固定在电极表面的CDNA密度和随后检测ATP的响应信号会趋于增加。坦，表明固定在电极表面的CDNA密度接近饱和。此，为以下实验选择了10μmol/ L的CDNA修饰电极。外，选择了27个碱基的寡核苷酸链（RDNA）进行比较实验，RDNA 3’末端的12个碱基与CDNA 3’末端的12个碱基互补，其余的碱基来自传感器的时间库仑响应信号的值与CDNA杂交DNA的时间基本相同，这证明DNA序列对电极的初始信号没有影响。是，将电极与1 mmol / L ATP孵育后，来自修饰电极的同步库仑响应信号没有显着变化，表明RDNA无法识别’ATP。3A是使用时间库仑技术在由dsDNA修饰的金电极上测量的安森曲线。图的顶部到底部检测到的ATP浓度分别为0、1 nmol / L，10 nmol / L，100 nmol / L，1μmol/ L，10μmol/ L和100μmol/ L。”ATP为1 mmol / L，所得曲线与检测100μmol/ L ATP所得的曲线几乎重合，证明检测100μmol/ L ATP时传感器已达到检测上限ATP。中，Qad是处于吸附状态的RuHex发生氧化反应时的法拉第量。实验条件下，其余参数可以认为是恒定的。F是法拉第常数，n是电子转移数，A是电极面积，C0O是氧化态RuHex的初始浓度，D是还原RuHex的扩散系数，Qdl是在电极表面形成双电层所需的电量。据公式（1），假设公式的所有其他参数均为常数，则Qad与Q（t）成比例。Qad值可以从Anson曲线上t = 0处的截距中获得。图3B中可以看出，ATP浓度在1 nmol / L至100μmol/ L范围内的对数与t =时原点纵坐标（ΔQ）的增加成正比。Anson曲线的0（ΔQ（μC）= 0.085lgCATP（nmol / L） 0.014，R = 0.995）。感器的检出限为0.5 nmol / L（S / N = 3）。用该传感器检测大鼠脑透析液中的ATP含量，计算出的大鼠脑透析液中的ATP浓度为（19.2±3.7）nmol / L（n = 3），这与[22]中报道的结果一致。查了传感器对类似物ATP CTP，GTP和UTP的响应。CTP，GTP和UTP的浓度均为1 mmol / L，ATP的浓度为100μmol/ L。4的结果表明检测到的响应信号ΔQ为100μmol/ L d使用该传感器的ATP是CTP，GTP和UTP响应信号1 mmol / L的10倍以上，表明构建的适体传感器具有良好的选择性。感器的CDNA固定在电极表面，适体通过杂交与CDNA连接。检测到ATP样品后，核酸适体从电极表面解离，因此传感器的再生只需将检测到的传感器与DNA溶液一起孵育即可。温10μmol/ L的溶液2 h，使DNA和电极表面固定。
以进行CDNA重新杂交。5显示了该传感器以及检测到1 mmol / L ATP前后经过5次再生的传感器的电化学响应信号。过5次再生后，电极对ATP的响应仍然可以达到更高初始电极响应的90％。证据表明该传感器可以重复使用，可以有效降低检测成本。立了可复制ATP适体的时间库仑电化学传感器。体的互补链cDNA固定在电极的表面上，并且通过杂交将适体与cDNA连接。
标分子与适体结合，使其与电极表面解离，吸附在电极表面的RuHex相应减少，从而使库仑信号的时间减少。感器设计方案通用且简单，并且传感器易于再生。用该传感器检测大鼠脑透析液中ATP含量的结果与文献报道一致，表明该传感器可用于测定真实的生物样品。
本文转载自
恒温阀芯 https://www.wisdom-thermostats.com