一种新型的甲胎蛋白（AFP）夹心免疫传感器已经建立。用金纳米颗粒-氧化石墨烯-普鲁士蓝纳米立方体（AuNP-GO-PBNC）标记二抗甲胎蛋白（AFP）和三氧化二铁-聚多巴胺-铁-铁将制备的（Au-PDA-磁性纳米复合物Fe 3 O 4）固定在其自身产生的磁性电极的表面上，并通过吸附固定第一抗体AFP。极上的非特异性吸附位点被牛血清白蛋白（BSA）封闭。37°C下与AFP抗原溶液孵育50分钟，最后在标记有纳米复合AuNP-GO-PBNCs的二抗溶液中孵育电极。此基础上，建立了使用普鲁士蓝标记（PB）检测夹心式免疫传感器的方法。AFP方法。最佳实验条件下，PB催化的H2O2氧化和AFP浓度的响应电流显示出两个线性关系，线性范围分别为0.005至1，000 ng / ml和1至20 ng / ml。检测限（LOD，S / N = 3）为1.0 pg / mL。方法具有灵敏度高，选择性好的特点。胎蛋白（AFP）是临床诊断中常用的特定肿瘤标志物，对于原发性肝癌的早期诊断具有重要的临床意义。前，血清中甲胎蛋白的检测主要采用放射免疫法，电化学发光法，化学发光法和酶免疫法[1〜5]。射免疫分析法可以达到AFP的纳克水平，但存在放射性污染。化学检测方法较快，但检测成本高于免疫酶法。学发光法技术较为成熟，但检测时间较长。方法（ELISA）简单，灵敏，特异，快速且易于自动化，广泛用于生物工程[6]，临床诊断[7-9]，药物和环境分析[10-12]。ELISA方法通常使用标记有酶的抗体（或抗原）。记的酶通常是低分子量且易于制备的辣根过氧化物酶（HRP）[7，12-14]。而，HRP的本质是蛋白质，并且在使用过程中存在失活的问题。
了克服HRP和其他标记酶的缺点，许多具有过氧化物酶类型催化活性的纳米材料被用于ELISA检测方法[8-10]，其中普鲁士蓝（PB）具有独特的三维网络结构。有稳定性好，制备成本低的优点。外，它还具有出色的电化学可逆性，作为电子转移介质，对过氧化氢具有良好的电催化能力[15]。PB代替常规抗体或抗原来标记酶蛋白可以克服现有酶标记方法繁琐操作，成本高和容易酶灭活的缺点。墨烯具有导电率高，比表面积大和成本低的优点[16-19]。用石墨烯作为PB载体可以大大增加PB的电荷，此外，还可以增加普鲁士蓝的稳定性[20]。性纳米材料Fe3O4具有良好的超顺磁性，低毒性和生物相容性，已广泛用于生物催化，生物标志物等领域[21〜24]。
性纳米材料具有很高的表面吉布斯自由能，可以降低系统能量并具有很高的化学稳定性。这项研究中，恒温阀芯制备了氧化石墨烯/普鲁士蓝（GO-PBNC）复合材料，并使用聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）功能化的带正电的GO-PBNC来吸附带负电的金纳米颗粒。（AuNPs）和AuNP-GO-PBNC纳米复合材料制备，并用该纳米复合材料标记二抗AFP（Ab2）。外，已经合成了Fe 3 O 4磁性立方体。于多巴胺（DA）与HAuCl4·4H2O的反应，形成了聚多巴胺（PDA）和金纳米颗粒。过原位化学氧化聚合制备磁性Au-PDA-Fe3O4纳米复合材料。磁性纳米复合材料Au-PDA-Fe3O4磁性固定在自制磁性电极的表面上后[25]，吸附并固定抗AFP，以制备用于检测AFP的磁性检测电极。
感器电极与含有AFP抗原的样品孵育；然后将结合了AFP抗原的电极与标记有纳米复合材料AuNP-GO-PBNCs的二抗孵育，并测量电极的电化学响应信号。普鲁士蓝为标记制备的夹心免疫传感器具有灵敏度高，检出限低，稳定性好的特点，在生物医学和临床诊断中具有潜在的应用价值。Quanta 200扫描电子显微镜（SEM，FEI，美国）； UV-2450紫外可见分光光度计（日本岛津市）; X射线衍射仪（XRD，英国比德）; Autolab PGSTAT30 / FRA2电化学工作站（瑞士瑞士万通）。用三电极工作系统，使用改良的磁性玻璃碳电极（MGCE）作为工作电极，使用饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极和金属丝电极铂用作对电极（CE）。
胎蛋白（AFP），抗甲胎蛋白（Bosai Biological Co.，Ltd.）;天然石墨片（99.8％，325目），多巴胺（DA，99％）（Alfa Aesar）;氯金酸（HAuCl4。H2O，99.8％），牛血清白蛋白（BSA，≥98％）（Sigma）。用0.1 mol / L Na2HPO4-NaH2PO4磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 5.91）作为支持电解质溶液。有其他试剂均为国内分析质量，使用前无需额外处理。验用水是超纯水（≥18MΩcm）。据[26]制备磁性Fe3O4纳米立方体。Fe3O4纳米立方体以0.5 mg / ml的浓度添加到1.0 ml PBS缓冲溶液中，在4°C下剧烈搅拌下添加500μL60 mmol / L（过量）多巴胺，然后添加300μL 2％（m / V）的HAuCl 4溶液并继续搅拌30分钟以获得磁性纳米复合材料Au-PDA-Fe 3 O 4。Ab2-AuNP-GO-PBNCs生物复合材料的制备采用Hummers方法合成氧化石墨烯（GO）[27，28]。超声条件下，将GO用水稀释在1 mg / ml的悬浮液中。5 ml在圆底烧瓶中，加入0.2 ml 5 mmol / l的FeCl3-K3 [Fe（CN）6]（pH 1.6），并在30°C的水浴中混合2 h 。液的颜色从黄棕色变为深蓝绿色，是GO-PBNC复合物。心，用水洗涤沉淀，然后离心直至上清液无色。图1A所示，在超声条件下，将制备的GO-PBNCs复合物添加到包含0.625mol / L KCl和1.25mg / ml PDDA的溶液中，并继续超声处理3小时。心后，将PDDA @ GO-PB NC复合材料分散在5 ml水中。
据[29]中的方法制备AuNPs，并在超声条件下将0.5 mL的PDDA @ GO-PB NCs复合材料添加到10 mL的AuNPs溶液中。混合物放置过夜，第二天离心，洗涤并分散在1 ml PBS缓冲溶液中添加150μL2.0μg/ ml Ab2，并在4°C下反应12 h，然后离心并用100 ml封闭μL的1％BSA（w / w）获得复合材料Ab2-AuNP-GO-PBNC。心并将沉淀分散在1 ml PBS溶液中直至使用。饰电极的制备和AFP的检测根据[30]制备磁性玻璃碳电极（MGCE）。合10毫克石墨粉和1.2毫升石蜡油以制成碳糊，然后将适量的碳糊填充到长50 mm，直径3 mm的PTFE管中，然后插入PTFE管中的铜线。一端，将一个直径为2毫米，直径为3毫米（表面会产生0.2 T的非均匀磁场）的圆形磁体放在距喷嘴约2毫米的另一端，然后将厚度为2 mm，直径为3 mm的玻璃碳放置在一起，将磁铁和玻璃碳紧密连接在一起，并用胶将玻璃碳的边缘密封，以获得磁性玻璃碳电极。次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3在麂皮上抛光制备的MGCE，然后用超纯水，无水乙醇，0.1 mol /用HNO3和超纯水进行超声波清洗，然后用氮气干燥。
取6μLAu-PDA-Fe3O4磁性纳米复合材料悬浮液，并小心地将其施加到MGCE的表面上。极，在室温下自然干燥。备了Au-PDA-Fe 3 O 4改性的MGCE。修饰的MGCE浸入一级AFP抗体溶液中，并在4°C下过夜。室温下，将电极浸入1％BSA溶液中约1 h，并将其位置密封电极上的非特异性吸附以获得免疫传感器。准备好的传感器浸入不同浓度的AFP溶液中，孵育50分钟，然后吸取10μLAb2-AuNP-GO-PBNCs溶液。心地滴在修饰的电极上，并在用PBS擦拭之前放置约1个小时。体冲洗。修饰的电极浸入含有1 mmol / L H2O2的PBS溶液（pH 5.91）中，并通过差动脉冲伏安法（DPV）进行检测。疫传感器的制备和检测过程如图1B所示。GO-PBNC的扫描电子显微镜图像（图2A）可以看出，大小均匀的PBNC附着在石墨烯片状表面上。带正电荷的PDDA和带负电荷的AuNP吸附功能化，并在Au NPs表面附着一层均匀的膜（图2B）。UV-vis表征结果如图2C所示。线a是GO的吸收光谱，在230 nm处的吸收对应于双键C = C的π-π*跃迁[29]；曲线b是GO-PBNC络合物的吸收。光谱中，由于Fe3 的催化还原，GO表面的电子密度发生了变化，因此在230 nm处没有明显的吸收。而，由于PB中Fe2 和Fe3 的电荷转移[28]，在GO-PBNC络合物中约740 nm处出现一个大峰，表明PB在GO上成功生成[31]。曲线在530 nm处有一个吸收峰，这是AuNPs的特征峰[32]，因为用PDDA官能化的GO-PBNC配合物带正电并吸附了带负电的AuNPs，这进一步证实了已经成功合成了AuNP-GO-PBNC复合材料。述结果与电子显微镜的结果一致。用扫描电子显微镜（SEM）的表征结果（图3A）显示，所制备的Fe 3 O 4的平均粒径为30nm，并且粒径是均匀的。3B是Au-PDA-Fe 3 O 4复合纳米颗粒的SEM图像。有观察到立方颗粒的Fe 3 O 4。可能是由于当使用多巴胺原位合成金纳米颗粒时，Fe3O4纳米立方体被包裹在里面。3C是Fe3O4和Au-PDA-Fe3O4纳米立方体的紫外-可见光谱。Fe3O4纳米立方体没有明显的紫外线吸收（曲线a）；曲线b是PDA的紫外线吸收光谱，多巴胺的特征吸收出现在280 nm处[33]；曲线c显示了金纳米颗粒在530 nm处的吸收峰特征，表明在Fe3O4纳米立方体的表面上已经形成了金纳米层[34]，这与显微镜结果一致电子产品（图3B）。4显示了Fe3O4和Au-PDA-Fe3O4纳米立方体的XRD模型。射峰位于2θ= 30.2°（220），35.5°（311），43.2°（400），53.6°（422），57.08°（511）和62.9 °（440）在图4a中可见。准数据卡中的Fe3O4图重合，表明合成的材料是具有立方尖晶石结构的Fe3O4 [35]。4b显示Au-PDA-Fe3O4复合产品在2θ= 38.1°，44.4°，64.6°和77.6°处具有清晰的特征衍射峰，与Au（111 ），（200）和（220）。）和（311）晶面，表明产品的表面已经覆盖了一层金纳米颗粒[36]。外，由于Au是重金属元素，并且上述Fe 3 O 4的外表面覆盖有金层，并且Fe 3 O 4的衍射峰与衍射峰相比太弱。金，很难观察到。图是在外部磁场下拍摄的。Fe3O4的悬浮液为黑色，均匀分散。果将磁铁放在悬浮液的一侧并施加磁场，则所有的Fe3O4都会立即沉降，上清液将变得透明透明。述结果充分表明，Fe3O4纳米立方体具有良好的超顺磁性，可以在外部磁场的作用下固定在玻碳磁电极（MGCE）的表面上[37，38]。5A是在包含探针分子[Fe（CN）6] 3/4（5.0mmol / L）的电解质溶液中不同修饰电极的AC阻抗的复杂平面图。线a是裸电极阻抗图，几乎在所有频率范围内都是一条直线，表明探针分子可以轻松到达MGCE电极表面进行氧化还原反应。电化学过程通过扩散来控制。Fe3O4-PDA-Au固定在MGCE电极的表面上时，Fe3O4-PDA-Au会阻碍探针分子在电极表面上的扩散，并且在高电位区域会出现明显的半圆形半圆的直径对应于电极的电子传递阻抗（Rct），约为145Ω（曲线b）。Fe3O4-PDA-Au修饰的电极吸附抗AFP后（曲线c），Rct增大，表明抗AFP成功地吸附在电极MGCE / Fe3O4-PDA-上。MGCE / Fe3O4-PDA-Au /抗AFP / BSA可以通过用BSA封闭MGCE / Fe3O4-PDA-Au /抗AFP上的非特异性吸附位点来获得（曲线d），并在与AFP孵育后获得对于MGCE / Fe3O4-PDA-Au /抗AFP / BSA / AFP的免疫反应（曲线e），Rct逐渐增加，这证明在AFP与抗AFP之间的免疫反应后，与修饰电极A的表面也证明了Fe3O4-PDA-Au可以保持抗AFP的生物活性。是，将MGCE / Fe3O4-PDA-Au /抗AFP / BSA / AFP与GO-PB-Au NPs-Ab2进一步孵育（曲线f）时，Rct与免疫反应相比下降，这是由于GO和Au NP具有良好的导电性，因此探针分子可以轻松到达电极表面。压在0.2至0.5 V的范围内，扫描速度为50 mV / s。不同的修饰电极上进行了循环伏安法扫描（图5B）。良的PDA-Au /抗AFP / BSA / AFP电极未显示任何明显的循环伏安峰。电极改变Fe3O4-PDA-Au /抗AFP / BSA / AFP时，背景电流显着增加，表明Fe3O4具有很高的电导率，对提高信号强度有重要作用。前反应；孵育GO-PB-Au NPs-Ab2时，会出现一对对称的氧化还原峰，因为PB是一种良好的活性氧化还原分子。支持电解质溶液中添加1 mmol / L H2O2时，峰值电流减少量已大大增加。此，PB不仅充当电子介体，而且充当“人工过氧化物酶”的电催化剂。疫孵育时间已优化。长孵育时间后，响应电流也会增加。孵育时间超过50分钟时，响应电流信号基本保持不变，这表明当孵育时间超过50分钟时，链接到电极的AFP达到饱和，因此选择50分钟为最佳孵育时间。度也是影响免疫应答以及抗原和抗体稳定性的重要因素。15〜50℃范围内，免疫传感器的电流响应信号先升高后随温度升高而降低，并在37℃时达到最大值，因为温度升高对人体有益。善抗原和抗体之间的反应。度过高时，抗原和抗体的蛋白质分子可能变性，结合活性降低，这会减少GO-PB-AuNPs-Ab2的装配并降低PB相应的和催化响应电流H2O2。此，选择37°C作为最佳测量温度。
最佳实验条件下，使用DPV检测不同浓度的AFP的结果如图6所示。存在不同AFP浓度的情况下，来自传感器的电流响应信号显示出两个线性关系，线性范围分别为0.005至1，000 ng / ml和1至20 ng / ml，检出限为1.0 pg / ml（S / N = 3）。1给出了该方法与文献报道方法的分析性能的比较。相同的免疫电极对5 ng / ml的标准AFP溶液进行了6次多次测量，信号强度的RSD电化学响应为2.7％。相同条件下制备的六个免疫电极用于检测5 ng / mL的AFP样品。量结果的RSD为4.3％，表明该传感器具有良好的重现性。制备的免疫传感器在4℃放置30天后进行重新测试，电流测量值为初始电流响应的93％，表明该传感器具有良好的长期稳定性。了进一步研究传感器确定AFP的选择性，在最佳条件下，针对5 ng / mL AFP和其他干扰物质，包括癌胚抗原（CEA，5 ng / mL），牛血清白蛋白（BSA，5ng / mL）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg，5ng / mL），结果如图7所示。AFP免疫传感器比其他干扰物质大得多，表明所制备的免疫传感器具有很强的抗干扰能力。择性的。MGCE为电极，在复合材料AuNP-GO-PBNC的基础上成功构建了新型甲胎蛋白夹心免疫传感器，对AFP进行了灵敏检测。传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，成本低。制备的AuNP-GO-PBNC复合材料具有良好的导电性和较大的比表面积，可以用作电子介体，以催化过氧化氢和放大信号。免疫传感器制造简单，使用方便，价格便宜，在生物医学，临床诊断和健康检测中具有潜在的应用价值。
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