基于β-环糊精（βCD）的主客体竞争模型，构建了带有适体凝血酶转换的电化学传感器。过识别主体和βCD主体，将二茂铁改性的适体（Fc）固定在金电极的表面上。存在凝血酶时，适体从初始的垂直线性构型变为“ G四”。离电极表面的“链体”降低了适体探针的氧化还原电流强度，c “ Signaloff”。效应用于凝血酶的灵敏检测，结果表明在5.0×10mol / L（3σ）时，与其他蛋白质分子相比，该方法对凝血酶蛋白的检测具有很高的特异性，该传感器结构简单，重现性好，为生物血清样品中凝血酶的实时检测提供了一种有效的方法。血系统中重要的丝氨酸蛋白酶，在伤口愈合，血管止血，炎症，组织粘附和动脉硬化中起重要作用[1，2]。
调节肿瘤细胞的生长。激活正常细胞的致瘤性和恶性细胞转移方面，它在较低浓度下促进生长，在较高浓度下抑制其生长，甚至产生凋亡作用[3]。也起着重要的作用[4，5]。血酶含量是血液凝固功能异常的指标，因此，建立一种灵敏，快速的凝血酶检测方法来诊断疾病非常重要。述适体可以高特异性和选择性结合靶标，具有易于合成，易于修饰，稳定性高，配体扩展，非免疫原性和免疫原性的优点。于存储[6]。年来，体积检测方法已被广泛使用[7-12]。多文献报道了使用适体来构建电化学凝血酶传感器[13-19]。mol / L.Wang等。[21]在以@ GS和CoPd NP修饰的金纳米颗粒的基础上，使用硫醇标记的探针作为捕获探针，生物素标记的探针作为报告探针，使用形成的夹心结构检测凝血酶。限度低至5 pg / mL。
管这些方法可以有效地放大信号，但是它们在检测过程中需要几个识别步骤，并且操作过程很复杂。些研究人员利用电子从电极表面上电活性标记的转移来构建带有转换的“ Signalon”凝血酶的电化学传感器，例如Radi [22]和Katakis [23]等。记为Fc的适体通过硫氢基固定在金上。电极表面上将适体和凝血酶结合后，形成刚性结构“ G四链体”并接近该表面。极的电化学信号增加，从而进行凝血酶的检测。等。[24]设计了一种具有相同检测原理的凝血酶传感器，利用适体凝血酶的特异性结合，使亚甲基蓝（MB）标记在电极表面附近的适体上并改善信号，2.56×10mol / L的凝血酶响应信号约为白色的270％。种类型的传感器可测量由凝血酶识别前后标记物与电极表面之间的距离变化引起的电信号变化，尽管结构简单，但电子从电化学标记物中转移出来受适体链长度的限制。会影响灵敏度。糊精是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶的作用下产生的一系列环状寡糖的总称。通常包含6到12个D-吡喃葡萄糖单位，其中βCD是研究最多的，并且包含7个分子。个葡萄糖单位。糊精分子具有空心的圆锥形腔结构，其内部具有疏水腔，外部具有亲水环。特殊的空腔结构使环糊精具有出色的识别和包裹宿主分子（如有机分子，无机离子等）的能力。体与主体之间的识别可以使分子成为一个良好的组装系统。化学工业，环境保护等领域的研究受到了相当的重视[25]。这项研究中，“宿主信号识别”βCD和Fc的原理构建了“ Signaloff”开关类型的适体传感器，用于检测凝血酶。3’标记的Fc抗凝血酶适体利用βCD的识别和宿主Fc在修饰βCD的电极表面上组装（实验原理在图1中示出）。出电化学响应信号；在存在凝血酶的情况下，它可以与适体特异性结合，改变适体的构型，离开电极表面，阻碍电子的传递并减弱信号。这种方法中，适体与凝血酶结合后，标记物直接从电极表面分离，检测信号不受适体链长度的影响，因此灵敏度高。AUTOLAB电化学工作站（瑞士瑞士万通仪器有限公司）；使用三电极系统：金电极（直径为1.0 mm）作为工作电极，Ag / AgCl电极（饱和KCl）作为参考电极，铂电极作为对电极； 400 MHz核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克技术公司）。βCD（SigmaAldrich）;凝血酶，牛血清白蛋白（BSA），溶血酶（Biotech Bioengineering（Shanghai）Co.，Ltd.）;核酸适体序列：3’FcGGTTGGTGTGGTTGG5’（大连宝生物工程有限公司）。用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（超纯水系统） （来自美国密理博）。考[26]，将βCD（1.10 g，1.0 mmol）添加到20 ml含三苯基膦（5.20 g，20 mmol）和碘的二甲基甲酰胺（DMF）中（5.05 g，20 mmol）。氮气保护下，将混合体系在80°C磁力搅拌15 h，并将反应溶液浓缩约1/2，使pH值为9.0至10.0，然后将其加入甲醇钠的甲醇溶液（3 ml，8.0 ml），冷却至室温。
置30分钟以破坏反应中生成的酯，加入100 ml冰冷的甲醇和500 ml冰水以产生沉淀，收集沉淀，用冰水和甲醇冲洗，干燥得到白色粉末（6IβCD）（1.56 g，82％）。6IβCD（1.56g，0.82mmol）和硫脲（0.48g，6.4mmol）溶解在16ml DMF中。氮气保护下，在70°C下反应19小时后，减压除去DMF，然后加入NaOH（0.42 g，恒温阀芯1.05 mmol）。/ L），在氮气氛下加热回流1小时，用KHSO4水合物过滤沉淀，用蒸馏水洗涤并干燥以除去残留的DMF。所得澄清的悬浮液中加入少量NaOH澄清，加入KHSO4产生沉淀，过滤并真空干燥后得到白色粉末（0.85 g，83％），即即6SHβCD。到的1 H NMR化学位移为：δ5.92（d，J = 6.0 Hz，7 H），5.82（s，7 H），4.93（s，7 H），3.68（s t，J = 6 Hz，7 H），361（t，J = 7.5 Hz，7 H），3.19（brd，J = 15 Hz，7 H），2.77〜2.74（m如图7所示，（7 H），2.13（t，J = 6.0 Hz，7 H），在4 L的SHβCD摩尔溶液/ L中孵育2 h。过将适体在电极表面上的适体mol / L乙醇（1：1：V / V）溶液中组装12小时，用超纯水洗涤并通过在氮气流下干燥。
TrisHCl缓冲溶液中，使用差分脉冲伏安法（DPV）对制备的适体传感器进行电势扫描（扫描范围0.2〜0.6 V，增量为0.001 V，振幅为）。0.05 V脉冲，0.002 V / s扫描速率）记录峰值电流的大小。后将凝血酶添加到缓冲液中，在37°C下孵育5分钟后，测量峰值电流DPV，可以使用凝血酶添加前后的峰值电流差异进行定量检测。血酶。mol / L Fc溶液中10分钟后，在TrisHCL缓冲液中进行DPV扫描。着在金电极的表面。电极表面上的电子交换使裸电极的Ret值从345Ω增加到990Ω（曲线b）；在将适体装配在电极表面上之后，电极表面与氧化还原探针之间的负电荷会排斥并阻碍电子的转移，并且Ret值持续增加到1300Ω（曲线c），表明适体已成功组装；在与5.0×mol / L凝血酶相互作用后，适体的构型发生改变并离开电极，少数未反应的适体保留在电极表面，因此电极的Ret阻抗减小到1140Ω（曲线d）。0和5.0×10 mol / L的凝血酶处理制备的适配子传感器，结果发现DPV信号强度从1.0μA降低到0.1μA。
血酶浓度增加（见图5 a至f）。于构型改变后，不同浓度的凝血酶与适体结合，因此Fc标志物远离电极表面，并且电子传输受到越来越多的阻碍，这表现为信号减弱当前。查传感器对其他蛋白质分子的响应，并使用传感器检测TrisHCl缓冲液，5.0×10mol / L的BSA，5.0×10mol / L的溶菌酶和5.0×如图6的点a至点d所示，凝血酶为10mol / L，结果表明，仅凝血酶组的信号显着降低。
凝血酶的5.0×10mol / L中，BSA，溶血酶，BSA和溶血酶分别以凝血酶浓度的10倍和100倍进行混合。
凝血酶的测定无干扰，检测到的信号峰无明显变化（图E〜j）（图6），表明传感器检测凝血酶没有不受其他共存蛋白质分子的影响，并且可以实现特定的凝血酶检测。了研究该传感器的实际应用性能，江西中医药大学附属医院（江西中医药大学附属医院）健康志愿者的血清样本）进行恢复实验。TrisHCl缓冲液稀释5μl血清样品10次，然后加入不同浓度的凝血酶，实验结果列于表1中，回收率为95.5％至104.1％， RSD为4.8％至8.0％。效测试样品的要求。新测试凝血酶mol / L，发现DPV信号与再生前基本相同，如图7所示，连续6次再生后电极响应基本不变。旦构建的分子识别传感器与靶标结合，Fc就会与适体一起离开电极表面。重新使用时，识别过程不会受到影响，并且具有良好的可重复性。研究基于宿主-客体竞争模型构建的适体传感器成功检测了凝血酶。旦适体探针与目标凝血酶结合，它就会从电极上脱离，从而最大程度地改变信号并克服了过去的这种情况。感器灵敏度有限的缺点。时，与通过用金-硫键固定适体而构建的传感器相比，使用改进的主客体识别电极更容易再生传感器。
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