已经开发出一种基于聚（3，4-乙撑二氧噻吩）（PEDOT）和天青I（天青I）的电化学免疫吸附剂，可灵敏地检测甲胎蛋白（AFP）。铂圆盘电极的表面上，将PEDOT进行电化学聚合，并通过静电组装技术固定azur I和纳米金（nanoAus）颗粒，以及甲胎蛋白抗体（antiAFP）组装在nanoAus的表面上。过用辣根过氧化物酶（HRP）阻断非特异性吸附位点来制备标准的AFP免疫传感器。用循环伏安法和扫描电子显微镜研究了组装过程和电极性能，并讨论了影响免疫检测器性能的因素。优化的实验条件下，电极响应呈线性，AFP浓度在0.01至120μg/ L之间，检出限为0.003μg/L。
过这种方法得到的AFP含量，得到的结果与通过常用的ELISA法得到的结果没有显着差异。胎蛋白（AFP）的血清含量是早期诊断原发性肝癌和畸胎瘤的疗效，观察疗效以及收获后判断的重要指标。前，检测PFA的临床方法包括酶促免疫吸附测定（ELISA），放射免疫测定，化学发光和荧光[1，2]，但灵敏度较低，恒温阀芯重大或放射性风险。不够目前的免疫传感器将电化学检测特性与ELISA相结合，具有以下特点：高灵敏度，操作简单，干扰少。电化学免疫测定中，标记抗体的量直接影响免疫传感器的灵敏度[3-6]。此，开发新的抗体标记材料和增加抗体负载是提高免疫检测器灵敏度的关键。（3，4-乙撑二氧噻吩）（PEDOT）是一类功能性聚合物，可以直接用作功能性电极基质膜[7，8]。为一种生物染料，Azure I是一种相对活跃的电子转移体[9，10]。于上述原理，本实验研究了在抗金属蛋白抗体（antiAFP）固定的铂圆盘电极表面修饰的纳米复合材料PEDOTAzure I和nanoAus的当前免疫学类型。疫传感器基于PEDOT和Azure I的协同作用，以促进电子在酶的活性中心和电极表面之间的转移，同时，带负电荷的nanoAus被固定在复合物PEDOT / Azure I的表面根据静电吸附原理，抗AFP固定。根过氧化物酶（HRP）代替了常用的牛血清白蛋白（BSA），可阻断非特异性吸附位点。于其疏松的多孔纳米结构，PEDOT可以有效增加电极的表面积和抗体的固定化，同时允许HRP对H2O2施加电催化作用，从而可以放大反应。
项纳米技术增强了酶催化的底物。
号增强的组合允许信号的双重放大，以产生高灵敏度的电化学免疫传感器。CHI 660B电化学工作站（上海晨华仪器有限公司），S4800扫描电子显微镜（日立公司）。EDOT（纯度> 97％，拜耳公司）。Azure I（Coleman Bell），AFP套件（郑州博赛生物技术研究所），HRP（Sigma），H2O2（30％，每秒重量，上海化学试剂公司）。[Bmim] BF4（> 99％，兰州绿色化学和催化中心），氯金酸（Sigma）。有其他试剂均为分析纯。过将氯金酸还原至100°C [11]制备NanoAus，其平均粒径为16 nm。
有溶液均在超纯水中制备。氧化铝粉在镜面上抛光铂圆盘电极（= 1 mm），用超纯水冲洗，然后用乙醇和水超声清洗。纯并用氮气干燥。清洗后的电极浸入含有0.1mol / L EDOT的[Bmim] BF4中，并在工作电位为 1.25V的恒定电势下（纱线Ag）进行电聚合。到用超纯水洗涤的PEDOT蓝膜；将5％的Azure I溶液施加到修饰电极的表面上。燥后，洗涤稳定性不足的Azure I并将其浸入nanoAus溶液中8小时。于30μL的0.05 mg / mL AFP中。PBS mol / L（pH 7.4）的溶液中，于4°C放置过夜，用pH 7.4的PBS溶液洗涤，浸入0.05 mol / L的PBS溶液中（ pH 7.4）含有0.4 mg / mL HRP并放置在4°c。准备好的电极在4°C下保存直至使用。
备免疫传感器的过程在图2中示出。免疫传感器与测试抗原特异性结合之前和之后，通过电流变化值对抗原进行定量分析。测试抗原特异性结合抗体时，所得的免疫复合物会阻止H2O2接近酶催化作用，响应电流降低，电流降低值随抗原浓度的增加而增加。免疫电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂板为对电极，通过循环伏安法（CV）检测电化学免疫传感器。每次实验前通入氮气30分钟，并将整个实验保持在氮气气氛下。描电势在-0.6至0.3 V之间，扫描速度为50 mV / s。于免疫测定，将固定有抗体的工作电极在不同浓度的抗原溶液中孵育20分钟（25°C），然后取出，用0.05 mol / PBS溶液洗涤。L（pH 7.4）并浸入2.5 mmol / L。V实验在PBS H2O2溶液（0.1 mol / L，pH 6.5）中进行。过CV方法研究了电极在不同修饰条件下的电化学行为（图2）。图2可以看出，当铂电极的表面被电聚合以修饰PEDOT膜层时，循环伏安电流显着增加（曲线b），这表明图1中的聚合的PEDOT已经被吸收。子液体电解质具有良好的电子传输性能[12，恒温阀芯13]。改变一层天青I时，电极具有一对良好形成的氧化还原峰（曲线c），表明天青I在电极表面上形成了良好的导电膜。在电极上修饰nanoAus时，由于nanoAus的电子通道功能，氧化还原峰值电流进一步增加（曲线d），这有助于电子在电极表面的传输。极。在电极上进一步修饰抗AFP（曲线e）时，由于蛋白质的分离，氧化还原峰电流大大降低，这阻碍了电子的传输。后，电极上的活性位被HRP阻断，氧化还原峰值电流进一步降低（曲线f）。过扫描电子显微镜（SEM）表征组装过程。3是各种修饰电极的SEM图像。图3a中可以看出，通过在离子液体中聚合获得的PEDOT具有疏松的多孔网络结构。
是由于离子液体的粘度较高，会降低单体的扩散速率，从而有助于形成多层多孔网络[14]。材料具有较大的表面积，可以有效地增加电极的表面积，增加Azure I电活性物质和antiAFP的固定量，加速电子在电活性物质和电极之间的转移，并改善免疫传感器的灵敏度。Azure I修改后，整个表面被交联以形成相对密集的网络（图3b）。在电极表面上修饰nanoAus时，观察到该表面被粒径为10Symbolm @ 8 m的颗粒覆盖（图3c）。
抗AFP吸附在修饰的电极上时，由于蛋白质的分离，其表面变得模糊，这表明抗AFP已在电极表面成功修饰（图3d）。极表面上HRP的修饰具有两个功能：阻断电极表面上未被占用的活性位点，以避免非特异性反应，并根据HRP的催化作用放大免疫反应信号。H2O2。4a是在添加和不添加H2O2的情况下添加到pH 6.5的PBS中的改进的电极CV图。溶液中不含H2O2时，曲线2中会出现一对Azure I氧化还原峰。添加2.5 mmol / L的H2O2（曲线1）时，氧化电流减小，峰值电流增大。小从2.3μA增加到3.7μA。
用HRP代替BSA来阻止活动站点也可以放大电流信号[9]。
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