基于由核酸外切酶的特异性识别的Hg2 和转导的策略辅助信号的I（出I）富适体胸苷（T），用于快速检测汞的荧光分析方法人体尿液已经建立。定在该微板DNA的适体特异性地识别的Hg2 和折叠成的双链型永久发夹结构，其不能由特定外切我被水解单根绳制造的。核酸染料SYBR Green I（SG）插入发夹针以产生荧光信号。此基础上，可以进行Hg2 的定量检测。佳实验条件如下：将微板在50毫克/升的浓度覆盖有抗生物素蛋白，DNA涂层的浓度为75 nmol / L的，5 SG和1.2微升外切的我是使用。最佳实验条件下，该系统的荧光强度与Hg2 离子的浓度的对数线性关系良好，线性范围为2至500 nmol / L的检测限之间是1.5 nmol / L（3σ）。方法用于检测尿样中的Hg2 。收率介于91.2％至95.0％之间，相对标准偏差（n = 5）介于2.1％至4.6％之间。方法选择性好，操作简单。用HNO3KMnO4溶液氧化Hg2 尿液中的其他形式的汞后，成功检测到尿液中的总汞含量。DNA识别;核酸外切酶I;汞离子;放大信号;接受荧光分析; 20160424被接受本文由国家自然科学基金（No.21506087）资助。谁能与我们联系，电子邮他们富集器官如肝，肾和大脑，从而影响生殖和发育，以及致畸，致突变和致癌作用[1，2]。前，检测生物样品中总汞的方法主要包括原子吸收光谱[3，4]，原子荧光光谱[5，6]和电感耦合等离子体质谱[7， 8]等这些方法具有高灵敏度和分辨率。而，基于大型仪器和专业操作人员的样品预处理是繁琐的，不能满足快速筛选大量样品的需要[9，10]。
此，开发一种新的精确，灵敏，简便，快速，经济的汞检测技术具有非常重要的实用价值。Hg2 可以穿透DNA链的胸腺嘧啶碱基（Ty），形成稳定的结构“THg2 T”。此，构建了各种高灵敏度和高度特异性的Hg2 荧光传感器[11-13]。传统的仪器分析方法相比，核酸作为识别分子的荧光检测方法简单，快速，廉价，特别适用于实时现场检测。而，仍然存在诸如低检测通量，高错误信号率和难以直接应用于复杂生物样品的差距[14]。酸外切酶I（外切I）是特异性切割的单链中的3”，5′ ，并且不向DNA和双链RNA核酸外切酶。多研究已经应用Exo I来发信号通知核酸探针的转导策略，以便检测超敏感的生物分子，如核酸和蛋白质[15]。这项研究中，DNA固定在微孔板上以识别目标分子，并建立了一种新的高通量荧光分析方法，用于快速检测尿液中的Hg2 。Exo I辅助信号转换策略。用Exo I可降低错误信号速率并提高检测灵敏度。旦固定化DNA，分别进行鉴定和检测步骤，有效去除样品基质中背景荧光物质的干扰，并在样品中进行Hg2 荧光分析。杂的尿液样本。验和试剂仪器，SpectraMaxParadigm多功能酶标仪（Molecular Devices，USA）; Fluoro log 321荧光分光光度计（Jobin Yvon，USA）; UV2550紫外分光光度计（Shimadzu，Japan）; （太仓实验设备）; pH计PHS3C（上海雷磁仪器厂）;迷你离心机（Eppendorf，德国）。色96孔微量培养板（Corning）中，抗生物素蛋白和牛血清白蛋白（BSA，Sigma，美国），核酸外切酶I（外切余大肠杆菌，2650A，大连宝生物工程有限公司），DNA检测序列（ 5’BiotinGGAGTTGGTTGATTGATTTTTTCTTTCTCTCTTCTTTCT 3“）是由上海生工生物工程有限公司合成并用超纯水转化为100μmol/ L的储备溶液。实验中使用的缓冲液（碳酸盐缓冲液：0.5mol / L的Na2CO3NaHCO3，pH值= 9.0; PBS缓冲液：0.1mol / L的Na2HPO4KH2PO4，100毫摩尔/ L氯化钠，pH值= 7.4 PBST缓冲液：0.1mol / L.PBS，pH = 7.4，2mmol / L MgCl 2，0.12％Tween 20，结合缓冲液：25mmol / L TrisHCl，pH = 7.4 100mmol / L NaCl，2mmol / L MgCl 2，5mmol / L KCl）; SYBR Green I（10000x，DMSO）购自美国Invitrogen，并在使用前用结合缓冲液稀释100倍（100x工作溶液）;根据文献[16]制备0.5mmol / L的标准汞溶液，用结合缓冲液稀释。
度不同。经酸处理的带塞的聚乙烯塑料瓶取出尿液样品一次，并尽快测量密度并在4℃下储存，其他试剂为分析级。验用水是MilliQ超纯水（18.2MΩ.cm，Millipore，USA）。验方法抗生物素蛋白亲和素稀释至适当的浓度与碳酸酯缓冲液，覆盖有微量滴定板（100微升/孔），置于4℃下12个小时，然后用PBST缓冲液洗涤。
后，用1％BSA封闭1小时，用PBST洗涤3次。涂有抗生物素蛋白固定微孔板，含有100微升的DNA在PBS微孔板，在37℃下搅拌2小时，并通过生物素与亲和素5”通过。于特异性相互作用，将DNA固定在抗生物素蛋白包被的微孔板上。PBST以200μL/孔洗涤3次。后，加入1％BSA 1小时，洗涤PBST 3次。涂覆的DNA微板立即用于下一步测试。DNA识别反应的Hg2 （1）标准的Hg2 溶液稀释至一组浓度在结合缓冲液，然后定量检测加入到含DNA微板被检测到，由100微升然后，在室温下孵育40分钟以使DNA和Hg2 完全反应。后，1.2微升外切余的（5U /微升）和11微升10X缓冲液外切的I加入到每个孔中，并孵育在37℃下30分钟，将反应溶液倾析和洗涤3次使用200μL/孔的PBST缓冲液。
（2）荧光测量在鉴定反应后，将100μl5×SG溶液加入到微孔板的每个孔中，并在室温下温育10分钟。用荧光酶标仪测量荧光光谱。发波长为480nm，发射波长为520nm。入汞离子之前，荧光强度I0在加入Hg2 离子后测量，FI测定荧光强度和Hg2 的浓度进行定量IF和曲线分析工作被吸引了。际样品的测定（1）在4℃下加入储存的尿液样品进行回收实验，离心去除夜间顶层，加入2.0，10.0和50.0将nmol / L标准溶液Hg2 加入样品中，然后置于4℃过夜，然后再次离心以捕获顶层。朗的夜晚。过建立的方法确定荧光强度。
（2）总尿液检测患者尿样：第一转换其他形式的汞的尿Hg2 的：在10毫升的尿液中，添加浓HNO 3和1mL 1毫升6％KMnO4溶液并回流回流2小时;等待KMnO4溶液颜色消失，温度降至60℃以下，然后加入0.1mL KMnO 4溶液并加热溶液;然后用碱将溶液调至pH8.0并浓缩至原始体积[17]。后按照既定方法进行检测。验原理和可行性分析的实验原理在图1中标记的DNA序列的5“生物素附着于黑色微孔板的检测被示出包含多个碱基胸腺嘧啶（T），其可以被插入到基地TT基于Hg2 。它们之间形成稳定的配位结构（THg2 T），检测DNA可以特异性识别Hg2 。汞离子存在时，会发生构象转变的DNA结合的Hg2 后，（在图1 DNAHg）形成在“发夹”稳定的双链结构。Exo I是单链特异性3’，恒温阀芯5’核酸外切酶，不会分解双链DNA。这项研究中，DNA转化为稳定的双链“发夹”结构，Exo I无法水解这种双链结构[17]。SG核酸染料插入双链“发夹型”结构中以产生荧光信号。反，在没有Hg2 的情况下，固定在微板上的DNA被Exo I切割，因此没有发出荧光信号。该研究中，在完成鉴定反应后，使用微量培养板固定DNA以及Hg2 和DNA。离液相和固相，然后加入SG以测量荧光强度，复合底物和尿样的荧光成分。[18]对检测信号几乎没有影响。了验证该方法，上述进行了使用DNA的溶液中的检测反应，和之前和汞离子反应后的检测系统的荧光光谱的可行性，提出在图1中2.在Hg2 作用之前，系统的荧光信号很弱（图2，曲线1和2）;加入Hg2 后，系统荧光信号的强度显着增加（图2，曲线3和4）。液中的自由形态DNA具有松散的“茎环”结构，其中可以插入SG，显示出某种荧光信号（图2，曲线2）; DNA游离形式可通过外切我被水解，从而使溶液基本上不含荧光信号（图2，曲线1），其示出了背景信号可以与外切I.荧光信号中去除的曲线4比曲线3弱，这表明Exo I的添加导致部分未反应的DNA的切割，部分消除了原始背景信号。述实验结果表明Exo I的引入特异性地消除了背景荧光信号并提高了测定的灵敏度。抗生物素蛋白的优化浓度的实验条件下涂布抗生物素蛋白的涂层浓度优化进行了优化和在各种浓度的抗生物素蛋白涂层的测定在280nm前后的涂层溶液的DA吸光度值。3）结果显示当抗生物素蛋白浓度为50mg / L时吸光度值最大，表明施加到微板上的抗生物素蛋白的量是饱和的。此，在该实验中使用50mg / L的抗生物素蛋白进行包衣。DNA浓度的涂层用于固定抗生物素蛋白的50毫克/升的浓度，并涂以不同浓度的DNA的板（没有封闭步骤）后进行了优化，过量的汞离子的被认可并反应形成发夹型。双链结构之后，加入过量的SG核酸染料10分钟，并测量520nm处的荧光强度IF。此，如图4所示，当DNA包被浓度为75nmol / L时，IF最高，表明此时包被的DNA最高。此，在该实验中，DNA涂层的浓度为75纳摩尔/ L。抗生物素蛋白固定化的涂层SG的最佳浓度为50mg / L，DNA涂层的浓度为75 nmol / L的，用过量的Hg2 识别反应形成的双链结构型“发夹”分别与核酸染料5×，10×，20×SG孵育10分钟，测量荧光强度。此，如图5所示，当使用5×SG时，系统的荧光强度在520nm的波长处达到最大值，表明此时反应是饱和的。因此在该实验中使用5×SG。化外切余的剂量。DNA涂料浓度为75 nmol / L的和的1％BSA封闭液，DNA没有被识别，并通过外切水解直接我搜索的量5U /μL的Exo I（0.5，0.8，1.0）。1.2，1.5和1.8μL的效果）（图6）。SG的量为5×时，检测520nm系统的荧光强度。果表明，与外切余的剂量的增加，DNA的较大量用外切I和系统的荧光强度diminuait.Lorsque外切余剂量水解是在1.2μL时，系统的荧光强度最低，并且浓度的荧光强度没有显着改变。用量为1.2μL。性范围，并且该方法的检测限在最佳实验条件下，不同浓度的Hg2 和DNA的传感器的荧光光谱（λex= 480nm处，λem= 520 nm）的已测量。果显示在图7a中，具有Hg2 。着浓度增加，520nm处的荧光强度IF逐渐增加。Hg2 的浓度范围为2至500nmol / L时，IF和Hg2 浓度的对数显示出良好的线性关系（图7b）。归方程为IF = 563805lgC 56994，相关系数（R）为0.9906。1.5 nmol / L（3σ）（0.3μg/ L）。汞水平在一定程度上反映了汞暴露的程度，人尿汞的正常参考范围小于或等于25 nmol / L [19]。方法的检出限和线性范围的下限远小于人尿的正常最大汞含量，可满足临床试验的需要。究了该方法的特异性以确定Hg2 的选择性。Pb2 ，Ni2 的，Cu2 和CO 2 ，Fe2 的，Ca2 和Zn2 的加入到尿液样本和最优的实验条件下进行测试。干扰离子的浓度大于Hg2 浓度的100倍时，不同阳离子的荧光响应显示在图3中。
8.只有Hg2 可以显着增加系统信号，表明荧光传感器对Hg2 具有良好的特异性。际尿液样本中Hg2 的检测通过原子荧光光谱法检测未检测到Hg的尿液标本进行标准加入实验，回收率和相对标准偏差已经计算好了。果如表1所示。个水平的回收率为91.2％至95.0％，相对标准偏差为2.1％至4.6％。表明该方法具有良好的准确度和灵敏度，可以满足生物样品中Hg2 污染检测的要求。外，实验表明尿样中存在复杂成分（钠，钾，氯，硫酸盐，磷酸盐，铵，Ca 2 等无机盐;包括尿素，尿激酶，表皮生长因子，生长激素，红细胞）。长素，促性腺激素，激肽释放酶和抗肿瘤肽对Hg2 的检测没有影响，表明该方法具有良好的特异性。两份尿样（原子荧光光谱法，总汞含量分别为17.3和12.2 nmol / L），以及尿样中的其他形式的汞根据2.2.4的方法将其转化为Hg2 ，然后根据最佳经验。17.1和12.5nmol / L的相应条件下测量总汞含量，相对标准偏差为3.6％至5.5％（n = 5）。测结果与原子荧光光谱法结果一致，表明该方法具有良好的准确度和灵敏度，应用于真实临床样品的检测。论使用微孔板固定DNA作为识别分子，开发了基于核酸外切酶I的荧光检测平台，以便对测试样品中的Hg2 进行荧光分析。液。方法具有操作简单，灵敏度高，特异性好等优点，满足高通量样品检测的要求，适合现场分析。于检测临床标本尿液中的汞非常重要。时，该研究为检测血液和头发等生物样品中的总汞提供了新思路。考文献陈莹，邵玉芳。境化学，2012，31（12）：1934-1941陈莹，邵玉芳。境化学，2012，31（12）：1934-1941。静，孙海娟，冯旭乔科学技术在食品工业中，2014年，35（7）：357-363赵菁，孙海娟丰须瞧，科学和食品工业的技术，2014年，35（7）：357-363沙阿AQ卡子TG贝格JA，阿夫里迪HI Arain MB食品化学，2012，134（4）：。345年至2349年德热苏斯，AV Zmozinski，MA维埃拉里贝罗AS，席尔瓦MM MICROCHEM。J.，2013，110（9）：227-232 Yun ZJ。他，B.，王ZH，王江T. GB Talanta，2013，106（6）60-65席尔瓦DG，葡萄牙塞拉AM费雷拉SLC塞尔达五，食品化学，2013，137（ 14）：Souzaa的159-163 SS，Campiglia AD，Barbosa F. Anal。ACTA 2013，761（2）：11-17王蒙维岳冯，张方，王兵，史俊文，李白，柴之芳，赵玉良，中国J.肛门。志，2005，33（12）。671年至1675年，王蒙，冯维岳，张方，王兵，史俊文李白柴之芳，赵渔梁。析化学，2005，33（12）：1671年至1675年张秦龙，高歌，刘Yapan，中国科技期刊的健康实验室，2015年，25（20）：3416-3418，秦龙章，高刘伟Yapan。国卫生监督，2015年，25（20））的：3416-3418杨学记，HUNG CanDong – 物理检测和化学分析 – 第二部分：化学分析，2015年，51（7）：955-958杨雪肌，黄参东 – 化学物理和化学测试，2015年，51（7）：955- 958 LEI赵经理，张CunZheng，胡QiuHui，刘源，恒温阀芯张强，刘陷进，中国J.肛门。志，2012，40（12）。827年至1831年，赵经理磊，张Cunzheng胡Qiuhui，刘源，刘陷进。析化学，2012，40（12）：1827-1831翟坤，董山祥，朱军，胡红清。国J.肛门。志，2015年，43（8）：。125年至1129年，Xiangdongshan，朱骏，胡鸿庆，分析化学，2015年，43（8）：1125年至1129年鲁C，PJ黄莹Y，刘静BIOSENS，Bioélectron 。015，79：244-250丘陵赵刘玲玲杨丽娜振宇张，中国J.肛门，到2014年，42（5）：683-688，赵邱瘀，刘灵灵，杨丽娜，张震宇，化学分析，2014年，42（5）：683-688文力，许丰州，SE晓晓王克敏，SE Dinggeng，青太平，邹振，中国J.肛门..杂志，2015年，43（11）：。
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回收率在富集的人尿样中，样本为96.3％至100.5％，相对标准偏差（RSD）为2.1％至4.6％。择性好，操作简单，可用于氧化离子HNO3KMnO氧化尿液中其他汞离子后的总汞含量。键词DNA识别;外切核酸酶I;汞离子;信号放大策略;荧光分析
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