通过表位法制备电化学胰岛素分子指纹传感器。肽胰岛素的M端子用作模板分子和自组装在Au电极和邻苯二胺作为功能性单体制备通过聚合分子印迹聚合物膜电化学。应于C-末端胰岛素多肽的三维结构的分子印迹孔可以通过用NaOH作为洗脱液洗脱模板分子来特异性识别胰岛素。岛素分子的重新吸附，K3后的[Fe（CN）6] / K 4 [Fe（上CN）6]被用作探针来测量胰岛素的间接测量通过测量由探针产生的电流的量电极表面。浓度范围为1.0×14 10Symbolm @ @@〜5.0 10Symbolm×13摩尔/ L，在传感器的电流响应具有与胰岛素浓度的良好的线性关系，检测限为7.24 ×10Symbolm @@ 15 mol / L（3σ）。传感器具有良好的选择性和稳定性，已成功用于血清样品中胰岛素的测定。岛素，分子印迹，电化学传感器，确定表位胰岛素是调节碳水化合物和脂质的代谢在体内[1]，这促进糖原，脂肪和蛋白质合成所必需的激素以及人体细胞生长发育和人类健康非常重要。前，胰岛素的检测方法主要包括酶免疫测定法[2]中，免疫发光测定[3]，放射免疫测定法[4]和高效液相色谱法[5，6] 。些方法具有对干扰敏感，测试条件困难和昂贵仪器的缺点。此，建立一种简单快速的分析方法来识别胰岛素非常重要。子印迹传感器因其良好的特异识别能力和简单的操作而迅速发展[7]。
们广泛用于检测蛋白质等大分子[8-10]。Prasad等。用[11]作为胰岛素模板分子和磷脂酰胆碱作为官能单体，以制备在碳纳米管多壁的表面具有通过自由基聚合的分子印迹聚合物（MIP）改性的电极，用酪氨酸含有胰岛素。过在0.8V下产生不可逆的氧化峰来测试残留物的胰岛素。于胰岛素的构象多样性，空间位阻的影响是重要的，这导致模型分子的洗脱不可能。岛素活性低，直接测量氧化电流低，氧化电位过高，样品中存在的共存还原物质容易产生干扰。
方法的表位[12-14]是近年来发展蛋白质印迹的新方法使用的特征肽与蛋白质表面分子作为制备的分子印迹聚合物的模板和三维孔形成的特异性识别多肽，然后鉴定蛋白质分子[15，16]，这避免了全局印刷基质分子不易洗脱的缺点。而，尚未报道通过表位方法构建分子印迹胰岛素传感器。该研究中，半胱氨酸修饰的胰岛素C-末端多肽在Au电极的表面上自组装。为模板分子，使用邻苯二胺（oPD）作为功能性单体，通过电化学聚合制备C-末端胰岛素多肽。子印迹膜：分子指纹膜上一个明确鉴定的膜，可特异性识别多肽，从而鉴定出整个胰岛素分子。
过测量由所述传感器产生的K3氧化还原电流进行胰岛素含量的间接测定的[Fe（CN）6] / K 4 [Fe（上CN）6]上的电极。验仪器和试剂CHI660D电化学工作站（上海晨华仪器有限公司）; AL204电子分析秤（梅特勒 – 托利多仪器有限公司）; KQ3200DE数控超声波清洗机（昆山超声波仪器有限公司）; PHS3D号酸度计（上海雷磁仪器厂）;采用三个电极系统：工作电极是Au电极（d = 2.0 mm），本Ag / AgCl电极是对电极，参考电极和铂丝电极。苯二胺，甲醇（中国的化学试剂医药集团），K 3的Fe（CN）6，K 4的Fe（CN）6，Na2HP04.12H2O，NaH2P04.2H2O和其他试剂（希仪化学有限公司）;半胱氨酸修饰的胰岛素C末端多肽（CysAlaLysProThrTyrPheGly，Shanghai Jiepept Biotechnology Co.，Ltd。;胰岛素（大连美伦生物科技有限公司）。非另有说明，否则实验中使用的试剂为分析级，实验水为双蒸水。肽溶液胰岛素C-末端的制备：胰岛素溶液1.0×10Symbolm @ 4摩尔/升的PBS缓冲溶液中制备0.02摩尔/ L（pH为C末端多肽7 ，4），储存在4°C并使用。备邻苯二胺溶液：在PBS 0.02mol / L（pH7.4）的溶液中制备5mmol / L的邻苯二胺溶液。验方法多肽自组装C末端转移的胰岛素C-末端多肽溶液适量在离心管0.5毫升，浸入的胰岛素溶液的C末端多肽抛光的Au电极1个小时与AUS键K3的[Fe（CN）6] / K 4 [Fe（上CN）6]作为探针，电极改性自组装由微分脉冲伏安法由（DPV），循环伏安法和自组装（ CV）和交流阻抗（EIS）表征。感器上的邻苯二胺制得的溶液转移到15ml的烧杯中，后C末端的胰岛素被用作工作电极上的多肽的自组装Au电极的制备，并且电解通过循环伏安法（CV）在为0.8V 0的电位，50扫描速度1mV /秒和10匝扫描圈进行，形成的分子印迹聚合物（MIP）。NaOH溶液以2毫米/ L。为洗脱剂的改性电极去除35分钟和模板分子的洗脱后的polyfilm磁力搅拌后，获得的分子指纹传感器。分子印迹聚合物（NMIP）的制备并不需要胰岛素对Au电极多肽C-末端的自组装，和其它步骤是相同的那些分子印迹膜。制备过程在图1所示。果与分子印记的讨论制备膜5毫摩尔/升的邻苯二胺在0.02摩尔/ L（pH为在PBS缓冲溶液中制备的溶液= 7.4）通过循环伏安法进行聚合，聚合电位为0~ 。0.8 V，扫描速度为50 mV / s。
果示于图2中所示的作为扫描轮的数量增加，逐渐电流减小并趋于稳定，表明邻苯二胺在Au电极[成功固化17。外，所述多肽胰岛素C-末端在这个电势范围内非常低的特征峰，因此，在胰岛素的C末端多肽的电极反应分子指纹膜的电聚合可以忽略不计。刷过程中循环伏安特性的分子印记传感器，而不是分子指纹传感器是根据第2.2.2节的方法和EDX方法制备的表征特征在于交流阻抗法2.5 ×10来测量电极的表面阻抗，间接地相对于分子印迹传感器。征。图4所示，在裸电极的情况下，电极的表面与在溶液中的电活性物质的直接接触，从而使阻抗是低的（图4a）。
转印膜在Au电极，膜密度导致大的阻抗的电极表面的（图4b）并且当所述模板分子在膜中被洗脱的分子印迹聚合，压痕形成的空腔用作电子转移的通道。此，电极表面的阻抗变得更小（图4c）：重新吸附后，所述多肽胰岛素的C端和胰岛素填充在印刷毛孔，防止探针离子穿过毛孔到达电极表面，并增加交流阻抗（图4d，4e）。）。脱（图4f）后，印刷孔不能形成与探针分子无法到达电极的表面上，替代阻抗没有变化基本上（4G）。组装和多肽胰岛素C-末端的判定时已通过不同浓度胰岛素的C末端多肽的自组装优化的1小时以制备的电极MIP时间洗脱后，用硫酸和甲醇分别优化3.0×10洗脱液的选择和洗脱。醇C-末端多肽用甲醇，乙酸，氢氧化钠等洗脱，作为洗脱剂的结果表明，目前主要是用硫酸，甲醇洗脱，甲醇乙酸（8：1，V / V）。有变化，表明上述溶液不能从胰岛素中洗脱C-末端多肽;洗脱用NaOH 2摩尔/ L为随洗脱时间洗脱剂，传感器电流逐渐增大，改变洗脱后的电极用不同浓度的胰岛素溶液和良好的结果吸收得到，表明NaOH可以洗脱模板分子。此，选择2mol / L NaOH溶液作为实验的洗脱液。化洗脱时间，结果显示在洗脱时间35分钟后探针电流趋于稳定，表明洗脱达到平衡。下实验中的洗脱时间为35分钟。吸附介质的最佳pH再吸收时间和再吸收时间是MIP电极特异性识别靶分子所需的时间。洗脱MIP电极是在胰岛素的C-末端多肽分别吸附（图6A中，曲线a）和在胰岛素溶液（图6A中，曲线b）和后的不同的DPV峰值电流记录时间。图6A所示，当吸收时间延长，胰岛素逐渐结合到压印标记的孔中，从而防止所述探针的扩散到电极，导致电流的逐渐减小当再吸收时间达到9分钟时，两个电极如图所示。流基本上不改变，表示打印机膜已与胰岛素和胰岛素的C末端多肽的再吸附过程平衡，从而使被选择的再吸收时间在随后的实验中9分钟。0.02 mol / L PBS缓冲液制备不同pH值的胰岛素溶液，洗脱的MIP电极在上述溶液中搅拌吸附9分钟，达到峰值电流。量探针分子的DPV。图6B所示，当胰岛素溶液pH = 7.4时，电流最弱，恒温阀芯表明传感器在pH = 7.4时对胰岛素具有最佳识别效果。复性和胰岛素是由同一传感器和测量的结果的相对标准偏差测量的2.5×10Symbolm六个重复@ 13摩尔/ L的稳定性为1.13％。过相同的方法制备六个分子指纹传感器。相同的实验条件下，测量2.5×10 S ymbolm @ 13mol / L胰岛素，测量结果的相对标准偏差为1.4％。
验结果表明，该传感器具有良好的重现性。外，传感器的稳定性还检查所制备的传感器在4℃下保存于PBS（pH值= 7.4）后3天，三个传感器组的电流响应下降2平均87％，平均电流在2周后降低不到5.0％，表明传感器具有良好的稳定性。用兴奋剂回收法进行实际样品分析，以测试来自桂林理工大学医院的100倍稀释的血清样品。果如表2所示。收率为94.5％~104.1％，表明该传感器可用于实际的血清型胰岛素。论首次检测，分子印迹胰岛素传感器是由表位的方法和制备的[Fe（CN）6] 3Symbolm @@ / @@ 4Symbolm被用作探针来间接测量胰岛素。
肽胰岛素C-末端被用作模板分子，从而有效地降低了空间位阻的影响在识别过程并简化洗脱步骤探针的测量灵敏度由定量分析在印刷电极上产生氧化还原电流，从而提高检测灵敏度。传感器具有以下特点：选择性好，检测限低，重复性好，操作简单，可检测胰岛素痕迹。RéférencesPuY，诸Z，汉d，刘男，刘俊，辽Ĵ，张K，谈W.分析师，2011年，136（20）：4138-4140Andersen L，迪内森B，乔根森PN，波尔森女，罗德ME临床。Chem。1993，39：578-582，Forest JC，Mass J，Lane A. Clin。
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