[目的]构建一种新型电化学DNA传感器，用于检测花椰菜花叶病毒35S启动子片段。[方法]采用玻碳电极用氨基多壁碳纳米管和靶DNA的捕获改性物通过纳米复合材料的DNA金纳米颗粒巯基嘌呤的吸附，固定得到多壁碳纳米管。接口和用过氧化物酶抗生物素蛋白和辣根改性的金纳米颗粒被用作信号分子在结构的端部，以完成整个夹层结构的传感器。试验使用循环伏安法测试用辣根过氧化物酶催化的过氧化氢获得的还原电流。[结果]该传感器可以提供靶DNA的定量检测与的线性范围为1×10-18〜1×10-11摩尔/ L和检测限低至6.95×10-20摩尔/ L，可以专门识别分歧。序并表现出良好的重现性和稳定性。[结论]该传感器在转基因食品检测中具有良好的应用前景。化学DNA的生物传感;花椰菜花叶病毒35S启动子;多壁碳纳米管;硫嘌呤;辣根过氧化物酶编号CLC TS207文档号A文章编号0517-6611（2018）17-0183 -04Abstract [目的]研究是构建一个DNA电化学传感器，用于检测病毒启动子花叶病毒花椰菜（CaMV35S）。[方法]电化学传感器DNA。们已经使用多壁碳纳米管由酸（NH3MWCNTs）官能化的引物用于固定ThiAuNPsDNA能够识别靶DNA和AuNPsHRPSA终端信号放大分子。交反应后接着在HRP循环伏安法作为电化学指示剂和H2O2作为酶底物[结果]传感器可以实现T-DNA的定量检测的目的，获得的1至10的直链范围18摩尔/ L至1×10 -11摩尔/升与6.95×10-20摩尔/ L（S / N = 3）的检测限。传感器还具有良好的应用前景，具有良好的选择性，可重复性和稳定性。[结论]该检测方法具有良好的食品检测前景。键词转基因电化学生物传感器DNA;花椰菜花叶病毒35S启动子，多壁碳纳米管;硫堇，辣根过氧化物酶基因食物与基因工程技术广泛进入普通大众生活的发展改进，其潜在的风险已经引起了全世界的关注。
前，转基因产物的检测方法通常基于检测的启动子和终止子，并且所述花叶病毒花椰菜的35S启动子被广泛地用作测试受试者。
1] DNA电化学传感器是用于检测使用核酸作为分子识别元件可检测的电信号引起的目标分析物的电化学特性的变化的方法。广泛用于分子生物学和生物技术研究等重要领域。3]。了提高传感器的灵敏度和选择性，一些纳米材料已经用于电化学传感器的构造。
壁碳纳米管（MWCNTs）具有良好的稳定性和高拉伸强度[4]。们的表面可以通过化学方法进行修饰以具有特定的官能团，从而固定分子，例如纳米复合物和生物酶。壁碳纳米管通常用于增加负载和活性分子的密度并且是用于电化学传感器[5-6]的结构的常用材料。如金，银和铂纳米颗粒的金属纳米颗粒经常用于电化学传感器的构造[7-11]。
粒子（AuNPs）具有高的表面积，良好的生物相容性和导电性，可以将它们固定化通过链路的Au-S和Au-N，共价DNA单链探针以及各种吸附金属纳米颗粒例如硫代嘌呤（THI）和辣根过氧化物酶（HRP）[12-14]，使金纳米颗粒以不同的方式来增加载荷传感器或活性物质，由此提高使用的电化学检测方法的灵敏度。者用多壁和金纳米粒子的碳纳米管以制备纳米复合材料，并且已经开发了新的电化学检测方法在35S启动子片段的病毒花椰菜花叶检测DNA花，增加转基因食品的检测灵敏度。测方法。料和方法试剂和仪器的MWCNT酸（NH3-多壁碳纳米管）购买南京籍盒有限纳米技术，氯金酸（HAuCl4），氏，购自国药化学公司H2O2。
和试剂猪辣根过氧化物酶（HRP-SA）获自四新生物技术有限公司，乙二胺四乙酸（EDTA），三购买后，tricarboxyéthylphosphine（TCEP）由于阿拉丁化学试剂有限公司有限公司化学试剂为分析纯，试验水为超纯水。叶病毒35S花椰菜启动子片段和相关联的序列通过上海生物工程技术有限公司序列合成下列：目标序列（T-DNA）：探针“捕获5′-GGCTCCTACAAATGCCATCATT-3（cDNA）的：5′-SH-AATGATGGCA -3 ‘探测信号（ANDS）：5′-生物素GTAGGAGCCAAA-3′ 单碱基错配的序列（UP-1）：5′-GGCTCCTACAAATGCGATCATT-3序列“错配3碱（MIS-3）：5′-GGCTCGTACAAATGCGATCTTT-3序列 “是（N-DNA）完全互补：5’-CATATACGTGGTCAGGTAGTAA-3的” 使用CHI832D电化学工作站在玻碳电极测定法（GCE）作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag / AgCl是参比电极的三电极系统。法制备缓冲液。先，恒温阀芯制备pH7.4浓度的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mmol / L.将100ml Tris-HCl缓冲溶液加入到0.1mmol EDTA中作为DNA储存溶液。100毫升Tris-HCl缓冲0.1毫摩尔EDTA，0.1毫摩尔的TCEP和5毫摩尔的NaCl作为cDNA的固定缓冲液。入100ml含有0.1mmol EDTA和5mmol NaCl的Tris-HCl缓冲溶液作为DNA杂交缓冲液。Thi-AuNPs-cDNA复合物的制备使用锥形瓶中，在加热磁力搅拌器添加100 mL的氯金酸溶液（0.01％）和煮沸，搅拌和加热，并添加1.4毫升的柠檬酸钠（1％）观察溶液的颜色变化，从浅黄色到酒红色。止加热以获得AuNPs溶液。100μlThi溶液（0.01mmol / l）与1ml AuNPs溶液混合并搅拌30分钟。合10微升的cDNA（10微摩尔/ L），10的Tris-HCl缓冲液（50毫摩尔/ L，pH值8.2）和10微升的TCEP溶液（10毫摩尔/ L）的微升并静置持续1小时。两种溶液混合，并在37℃下温育16个小时，然后在13 000转/分钟洗涤3次，并补充至1mL，用PBS缓冲液（pH 7.4），以获得将cDNA-氏-的AuNP纳米。杂[15]。AuNPs-HRP-SA制备。1ml溶液制备的AuNP的在离心管中，离心分离机以10 000转/分10分钟，弃去上清液并巩固300微升用PBS缓冲液（pH 7.4）中，以提高溶液的浓度金纳米粒子。入20的SA-HRP溶液微升（0.1毫克/毫升），充分搅拌，在4℃下进行24个小时，然后在8000转离心/分15分钟，离心3次，用缓冲液稀释，并储存在4°C。璃质玻璃电极的处理和传感器的组装。一GCE是一个3毫米直径研磨与依次1.00，0.30和0.05微米氧化铝粉末粒径用硝酸中的1的水溶液：1，乙醇和水的超含0.1mol / L的5毫摩尔/ L的铁氰化钾溶液自己超声波纯氯化钾用作碱溶液和电极已经通过之间循环伏安法（CV）反复测试获得-0.2和0.6V，直到电压差小于80mV的氧化还原峰，然后是超纯水。净，吹干N2。末NH3-MWCNT溶解于壳聚糖溶液中的10mg / mL为2小时，得到的NH3-MWCNT 1mg / mL的均匀的溶液。
图1中示出用于安装第一NH3-多壁碳纳米管传感器的方法逐滴加入5微升表面GCE中的溶液逐滴继续5uL的复杂氏-的AuNP-cDNA被静置，和干燥1个小时用0.1％SDS和电极的表面的Tris中的溶液用HCl缓冲液洗涤，得到氏-的AuNP-的cDNA / NH 3 WMCNTs / GCE电极时，所得的溶液电极依次并在一段时间内，在37℃温育TDNA ANDS溶液（1×10-9摩尔/升），然后将其依次用的Tris-HCl溶液和SDS溶液（0 ，1％）中5分钟，以除去非特异性杂交DNA，然后将5μl的金纳米-HRP-SA络合物逐滴添加30分钟后，一个Tris-HCl缓冲溶液中，用洗涤纯水并干燥，得到的AuNP-HRP-SA / T-DNA-T-DNA / cDNA的-氏-的AuNP / NH 3 WMCNTs / GCE用于电化学测试。化学试验方法。环伏安法（CV）来检测包含在PBS缓冲液（pH 7.4）-1.0 CV扫描范围1.5毫摩尔/升H 2 O 2溶液至0 V和速度的扫描速度为50 mV / s。果和复杂氏-的AuNP-DNA紫外光谱氏-的AuNP-cDNA的讨论紫外 – 可见光谱和相关的配合物都在图2中有氏特性的两个吸收峰（曲线a），位于到283和598纳米归因于π-π*芳香THI和过渡n时，C = N [15]的π*。
AuNPs的最大吸收峰（曲线b）出现在532nm处，这对应于AuNP典型的吸收峰[12]。THI-的AuNP-的cDNA（曲线d）时的三个峰，其中具有283纳米601 THI的发展相关联的吸收峰，与THI-的AuNP（曲线C），强大的峰值波长540相比〜565nm处出现，或纳米颗粒的吸收峰是从532纳米增加到561纳米由于cDNA和金纳米颗粒的自组装，指示氏-的AuNP-cDNA的复合体的成功制备。装铁氰化钾溶液的电极的传感器组件分析CV方法的电化学表征在图中示出3裸电极（曲线a）用一对的氧化还原峰的低铁，当电极的表面改性的NH3-多壁碳纳米管（曲线B），氧化 – 还原的峰值电流显著增加，证实NH3-多壁碳纳米管充分提高电极的导电性，加速电子转移。氏-的AuNP-cDNA的复杂修改的电极后，一对出现明显的非对称的氧化还原峰（曲线c）-0.15〜0.28 V，该电信号被显著改善，因为复合电极Th1和金纳米粒子的改进的电子传输能力表明，THI-的AuNP-cDNA的复合物成功地吸附通过链路的Au-N通过NH3-MWCNT的GCE电极的表面上。T-DNA和cDNA的温育（曲线d和e），所述AC响应电流由于负电荷的DNA的磷酸骨架，这阻碍电子的输送的显著下降，通过基于DNA的互补证明了tDNA和DNA的成功组装。电极上，形成夹层结构。测试条件的优化为了获得用于试验的最佳条件，所述pH衬底，衬底的H2O2的浓度，T-DNA和cDNA的温育时间的温育时间进行优化。
基质的pH影响HRP的活性：当T-DNA的浓度为1×10 -12摩尔/ L和T-DNA的温育时间和中的cDNA是90分钟，则AuNPs-HRP-SA组装电极用于不同的pH条件。/如在图4a中所示的T-DNA-T-DNA / cDNA的-氏-的AuNP / NH3-MWCNT / GCE为CV特性。pH为6.6和7.4之间时，电流降低CV逐渐增加，并且在pH 7.4达到其最大值，然后下降越来越多，这证明反应体系在pH为7，图4显示了最佳催化效果，这使得可以选择pH7.4的PBS缓冲溶液。H 2 O 2是HRP的反应底物，它的浓度影响H2O2浓度的优化当前catalytique.Les结果的幅度在图4b中示出。
H 2 O 2浓度达到1.5mmol / L时，峰值还原电流达到峰值并且此后保持基本恒定。此在H2O2碱的浓度设定为1.5毫摩尔/ L的时间T-DNA温育，温育时间长度ANDS T-DNA固定数目ANDS的影响和电极表面，并因此影响了数的SA-HRP-限制的AuNP，最终影响的峰值电流的大小，并在37℃的T-DNA和cDNA的温育时间温育的条件下被修改，最后，该测试CV在含有1.5mmol / L H 2 O 2的PBS缓冲液（pH 7.4）中进行，结果显示在图4c-d中。原峰电流时的T-DNA和cDNA的潜伏期增加，并且电流在90分钟和60分钟分别达到峰值，这表明由电极捕获探针的数量达到饱和那时，tDNA的杂交时间选择为90分钟。建DNA传感器，cDNA杂交时间为60分钟。
化学循环伏安法检测靶DNA时，不同浓度的HRP cDNA的数目与后电极连接的T-DNA将改变杂交，影响反应的电流的大小，所述反应中使用的最佳的T-DNA CV法对不同浓度在下列条件下进行优化的检测的：如图5所示，峰值电流增加与靶序列的T-DNA浓度的增加，峰值电流呈正相关在tDNA浓度和校准曲线（图6）显示峰值电流和分析物浓度。在T-DNA 1×10-18×10-15和1≤1≤1×10-15×10-11 mol / L的浓度，得到的基准曲线的对数之间良好的线性关系，分别。线性回归方程为I = 0.146 logC 2.93（R2 = 0.990），I = 0.080 logC 1.91（R2 = 0.983）。信噪比等于3，检测限为所述传感器的6.95×10-20摩尔/ L选择性，稳定性和再现性为了研究生物传感器的选择的识别的能力使用TDNA，1×10-12mol / L tDNA的4种DNA，Mis-1，Mis-3和N-DNA。别检测序列。-N-DNA的当前值接近相比的结果的白色和电流最大值失误1和误3 21.9％和66.4％下降表明ADNt.Les将错配碱基与tDNA的完全互补序列进行比较。列与捕获探针杂交的效率显着降低，这使传感器具有高选择性。经研究了电化学DNA传感器的再现性和稳定性。种不同的ECG电极来制备在1×10-12摩尔/ L的T-DNA浓度的条件要的AuNP-HRP-SA / ANDS -tDNA /氏-的AuNP-的cDNA / NH3-多壁碳纳米管/ GCE传感器电极组件CV测试，电信号电极3（RSD）为6.1％之间的相对标准偏差，这表明在检测过程可以被重复，并且重复性好方法。了研究的检测方法的稳定性，三种电极组合件置于在4℃下7天，所述响应信号已经被保持在原始信号的96％，使得能够构建成功地与NH 3 WMCNTs底部，氏-的AuNP-cDNA的纳米复合材料和复合组合模式的AuNP-HRP-SA研究是DNA分子的传感器信号的进一步的扩增特异性通过检测识别H2O2还原基于HRP和花叶病毒花椰菜35S启动子的DNA序列已为实验条件进行了优化，检测限低至6.95×10-20摩尔的条件下/ L最佳实验。电化学传感器简单，灵敏，重复性好，稳定性好，具有良好的转基因产品检测应用潜力。
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