硫胺素焦磷酸（TPP）是细胞中维生素B1的主要活性形式，是糖，脂肪酸和氨基酸氧化代谢的主要辅助因子。细胞中，由TPP适体和天然核酶组装核酶人工开关调节靶基因的表达，并且目前仅限于原核细胞，真菌或植物细胞。
该实验中，两种类型的核酶TPP开关，“合闸合闸”和“关机模式”在原核生物中筛选，通过PCR重叠延伸在非翻译区3“构造成蛋白质的报道基因（UTR）增强的绿色荧光（EGFP）。
胚胎肾（HEK293）的上皮细胞中进行转染，并通过荧光显微镜和流式细胞术分析通过不同浓度的TPP的观察EGFP表达的调节。果表明，“Switchon”核酶切换和“Switchoff”均显示出对TPP浓度的显着依赖性和良好的特异性。EGFP的荧光强度增加至150μmol/ L TPP。3.1倍，1.9倍和2.3倍。种结构直接转换通过在TPP的适体和核酶开关，这有利于代谢物或因子的标记活细胞中的特定动作中报告基因表达的变化TPP的浓度变化哺乳动物通过荧光检测。有损坏，可见和有效的检测。键词核酶开关焦磷酸硫胺，增强型绿色荧光蛋白，基因表达调控，荧光生物传感器，介绍在哺乳动物细胞中的核酶是一种人工基因调节开关出现在最近几年。见的核酶开关由锤头状核酶和适体组成[1]。为部分顺式作用，特异性识别适体的配体的作用下，它可以通过调节蛋白不支持的自切割反应调节mRNA的翻译，并已应用于对不同细胞的基因调控[2~6]]。现在为止，与富集的配体系统（SELEX）的指数型变化技术的发展[7]，越来越多的适体筛选特异性结合的小分子，蛋白质，肽，氨基酸，抗生素和金属。同的配体如离子[8-11]。天然核酶开关相比，人工核酶开关具有基因表达，结构组装和靶基因特异性的可控性特征[12]。过配体结合到所述适体区域引起的构象变化可以用来调节下游基因的表达，并把它们转换成相关的化学信号，例如报告基因的荧光修饰，以获得在原位和活细胞中配体的可视化。测如今，合成生物学的发展和使用中，逻辑门核电开关，促进了总部设在真核细胞中[13]核酶的广泛使用的生物传感器。磷酸硫胺素（TPP）是在细胞和糖，脂肪酸和氨基酸的氧化代谢的重要辅因子维生素B1的最活性的形式，并且在维持代谢中起着重要的作用，正常细胞生长和增殖。个角色。酶开关TPP是在原核生物和真核生物中发现的唯一天然核糖开关，在植物和真菌中更常见[14-17]。主要作用于真核细胞中PRN内含子的克隆，可以进行准确有效的基因调控。酶TPP开关具有用于TPP高特异性和亲和力，无论是在真核生物比原核生物，而其他组件或在所述细胞等具有低的结合能力的开关区域的适应核酶[18] ~20]对核酶的活性影响不大。献[21-24]报道，适体TPP和天然核酶在核酶开关组装人工TPP为靶基因的表达在细胞中的调节，例如在体外原核细胞或藻类。前，在哺乳动物细胞中使用的开关结构核酶的适体主要限于适体的配体，如茶碱，四环素和金属离子[25，26]。些配体是细胞外的并且通常表现出一些细胞毒性。TPP是真核细胞中重要的代谢中间体，其在细胞中的含量很低。经使用人工建立的核酶开关来调节哺乳动物细胞中的基因表达。
到现在，人工开关核酶TPP报道在原核生物中有两种类型的阳性和阴性对照[21]，其通常位于靶基因的5“端的。过配体和适体的作用，调节核酶是否裂解，释放或阻断RBS序列以促进或阻止下游基因表达[27]。真核生物中，不存在RBS序列和核酶开关通过抑制mRNA的剪接上调靶基因的表达或通过激活的裂解抑制靶基因表达MRNA [28，29]。前，基于核酶的人工开关的设计通常是通过合理设计通信模块组件的序列，然后与细菌或酵母mRNA整合进行功能筛选和优化来设计的。31]。
验仪器和试剂的Eppendorf的Mastercycler关系PCR仪（Eppendorf，德国），倒置荧光显微镜ECLIPSE尼康IT（尼康，日本）流式细胞仪BD Accuri C6（BD，USA）。磷酸硫胺素（> 95.0％，Sigma，美国），茶碱（> 99.0％，扩口北京科技有限公司），酶的DpnI（50U /微升，NEB，USA），T4连接酶（ 5 U /μL）。Invitrogen，美国，lipofectamine 2000转染试剂，DMEM培养基（Invitrogen，USA），小牛血清（Gibco，USA）。酶TPP切换质粒导入哺乳动物细胞中的构建从插入EGFP基因pEGFPN1载体的3“UTR区域中的锤头状核酶血吸虫mansonii（HHR）的序列衍生。粒pEGFPN1用作模板，5’重叠延伸PCR方法用于构建不含TPP适体区域的pEGFPHHR。PCR反应：预变性在94℃持续2分钟，在94℃进行30秒，在60℃下进行30秒，在72℃下1分钟，在72℃下25个循环10分钟。PCR反应体系：5微升的Phusion DNA聚合酶缓冲液的10×10，4微升的dNTP 10毫摩尔/ L的，F引物2微升，R引物，1微升的2微升，0.25微升的Phusion DNA聚合酶; ddH2O为50μL。乙醇回收PCR产物，DpnI酶将过量的质粒模板在37℃下消化到PCR产物中1小时。乙醇回收产物并干燥。接T4 DNA连接酶并转化到感受态细胞中并接种在LB平板中，在37℃下具有相应的抗性。间列车。除单克隆培养物，提取质粒并送至上海生物科技生物技术有限公司。于测序，BLAST序列已在GenBank中比对。产物成功测序用作型核酶的后续结构的模板上与适配器TPP /断开关的施工方法是与上述相同的和序列和相关的引物在表1中示出。有寡核苷酸和引物均由上海圣工生物技术有限公司合成。补充有10％小牛血清的DMEM中，在37℃和5％CO 2下进行哺乳动物细胞培养和HEK293细胞的瞬时转染。染前一天，将0.5mL DMEM /孔以5×10 4 /孔的密度加入24孔板中。据转染条件，质粒pEGFPTPPHHR的1微克和lipofectamine 2000的2微升转染到每个puits.PEGFPN1和pEGFPHHR分别为阴性和阳性对照4小时后，加入新鲜培养基和不同浓度（0-150加入μmol/ L）。）TPP或茶碱。光显微镜和通过转染48小时，用PBS洗涤，在488nm的激发波长的荧光激发后EGFP的细胞内表达的流式细胞术分析，观测长度在EGFP的515-545纳米的结果“发射波长和讨论pEGFPTPPHHRON质粒两种类型的人工开关核酶TPP的开/关结构：上调和négative.Que为原核生物或真核生物中，人工核酶开关的正调节或抑制的关键取决于适体结合结构域和核酶结构域。通信模块，其是适配器区域（茎III）和锤头状核酶（HHR）（图2A），循环结构杆（StemII）之间的寡核苷酸序列，所以TPP适配器区域和HHR心脏酶接头序列是确定核酶开关是“开启”还是“关闭”的关键。停止开关，锤头状核酶（HHR）的活性结构并不保持在不存在配体的，从而抑制核酶HHR的剪切。TPP配体结合可以引起核酶开关的茎 – 环结构的茎II和茎I之间的活性结构的稳定性，并且发生剪切。反地，开关结构是稳定的初始HHR可剪切结构而TPP的结合破坏HHR的活性结构，从而抑制剪切应力[21，23]的发生。三个开关（pEGFPTPPHHRoff1，2，3）和两个开关质粒（pEGFPTPPHHRon1，2）构建优化的寡核苷酸和在原核生物连接酶核酶6的不同序列的基础上。（图2B）（下文称TPPHHRon / off）。了确保其在真核生物中的调节活性，将所有开关模型插入到感兴趣的EGFP基因的3’UTR区域中。为要插入位于EGFP基因的下游适体HHR和CT的片段，它缺少一个方便的限制性内切核酸酶位点和序列是短的（约120至140碱基对）。统的限制酶消化PCR方法回收效率低，影响后续重组载体的构建。
此，通过重叠延伸PCR克隆[32]将核酶切换片段插入质粒的方法更有效和准确。个引物上游磷酸化，并且下游端5“被设计，其一部分已被插入与序列，而另一部分是下游位置互补和质粒的插入和整个长度的上游扩增基质质粒。过荧光显微镜和在HEK293细胞中报告基因EGFP的表达检测到在HEK293细胞中的EGFP基因的表达通过显微镜fluorescence.Les结果检测表明EGFP的表达高于转染pEGFPN1阴性对照的细胞。质粒pEGFPHHR转染的细胞显示荧光显着降低，显示出良好的核酶切割，但对TPP浓度没有耐受性（图3A）。着TPP，转染的细胞TPPHHRon1和2的绿色荧光的强度的浓度下显示出对amélioration.Au相反一显著倾向，在三个染的细胞通过切换内置断型，只TPPHRoff1随着TPP浓度的增加而增加。EGFP的表达显着降低（图3B）。而，TPPHHRoff 2，3显示荧光强度没有降低，其强度接近阴性对照，并且没有浓度依赖于TPP浓度。可能是由于接头的序列之间的不完全的对应，从而导致mRNA的二级构象[23]，这是由多种因素在哺乳动物细胞中，恒温阀芯这使得受影响的不平衡核酶的正确剪切功能更难[31]。了进一步探索对EGFP表达不同浓度的TPP的作用，具有改变的表达EGFP转染细胞系的平均荧光强度通过流式细胞术进行定量（图4） 。比于阴性对照，将转染的细胞系pEGFPHHR的荧光强度下降了近80％，表明该核酶HHR保持其高剪切作用在哺乳动物细胞中在该系统中建立。两种构建的激活开关中，TPPHHRon1在TPP浓度为50μmol/ L时显着增加荧光表达;在150μmol/ L时，平均荧光强度乘以约3.1，这接近于报道的对原核细胞的影响。[21]的功能，尽管另一个TPHPHron2的荧光强度增加，但通过开关控制功能和低调节TPP 150微摩尔/ L的增加仅1的表达， 8次。构建的TPPHHRoff1，平均荧光强度下降了2.3倍，当TPP的浓度为100毫摩尔/ L，则继续增加与配体的（150微摩尔/ L）的浓度，这对随后的EGFP表达抑制没有显着影响。个开关核酶回答TPP发现灵敏度TPP是约50-100毫摩尔/ L。
实验中，将TPP浓度增加至500微摩尔/ L，但它在各种被使用转染细胞系。有观察到明显的效果。之前的报道相比，哺乳动物细胞中的茶碱浓度为1-10mmol / L，TPP核酶开关对TPP底物的敏感性大大提高。而，这样的结果也证实，虽然核酶开关具有很好的效果调节原核或低等真核细胞中，结果并不完全适用于哺乳动物细胞。许多报道，原核系统中的核酶开关可以达到调节功能[23，30] 1.2〜10倍，虽然比的调整范围100-10000在体外[22的弯曲小得多]，但在真核哺乳动物细胞中。节作用较低，调节能力也将根据转基因或宿主细胞的类型进行修改[31]。比于相对简单的平移机构转录原核生物，通过核酶开关的正确形成mRNA在真核细胞中的二级结构的常受增加的转录翻译和其它相关因素，这增加了其监管的难度和不确定性。别。了测试TPP核酶开关的特异性，将茶碱加入到平行样品中。验表明，添加茶碱不会激活核酶开关的构象变化，从而影响报告基因的绿色荧光蛋白的表达。果表明，最初应用于适体原核生物的核酶开关的更高特异性可以在哺乳动物细胞中进一步保存。论两种类型的基于原核选择的适体TPP核酶开关进行了研究：通过TRP配体和人工核酶的核酶的切割的活化和抑制是在哺乳动物细胞中进行。节报告基因（EGFP）的绿色荧光蛋白的表达。使用此方法来间接地检测TPP的基于活动变构调节的下游的报告基因的活性mammifères.Cette细胞微策略的浓度有利于代谢物或无标记的因素，而不是检测通过荧光检测在活哺乳动物细胞中标记。伤检测，视觉和有效。然这种基本水平的原位检测需要比体外检测更高的基线水平（umol / L），但在未来，随着基因表达的级联扩增技术的发展，合成生物学和逻辑网格等结合这种方法的应用，这种类型的核酶生物传感器将具有提高哺乳动物细胞敏感性和广泛应用的巨大潜力[33]。SummaryThe焦磷酸硫胺素（TPP）是硫胺（维生素B1）的衍生物，在vivantes.À细胞糖，脂肪酸和氨基酸的氧化代谢的重要辅助因子存在，许多系统核糖开关已经开发了TPP依赖性人工药物来调节靶基因的表达。Limitine在细菌，真菌或植物细胞，锤头核酶开关依赖TPP激活（开关）和抑制（禁止），其来自筛选原核生物先前报道的结构，分别插入细胞哺乳动物。强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的UTR，用于通过重叠延伸克隆PCR构建有效的基于核酶的人工开关。改良的核酶开关以增加的TPP浓度转染HEK293细胞。过荧光显微镜和流式细胞术分析EGFP的基因组成能力。些TPP诱导基因调控装置已显示出配体与其优异特异性之间的明显依赖性。种构建体“合闸合闸”和“切换”分别实现增加3或1.9倍和减少2.3倍与150微摩尔/ L PPT EGFP的水平的。过调节细胞中的视觉报告的TPP基因的表达的浓度变化，能够高效率地开发生物传感器的未标记的，非侵入性和在哺乳动物细胞中vivantes.Réservoirs焦磷酸硫胺素核酶具有高度特异性;改善绿色荧光蛋白;基因表达调控因子;荧光生物传感器;哺乳动物细胞”
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